(2.2.1)-病理组织制片技术病理检验技术

病理组织制片技术——固定

基本技术流程取材

固定

洗涤

脱水

透明（媒染）

浸蜡（透蜡）包埋

切片（展片、贴片、烤片）

染色

封片一、固定和固定液

将组织浸入某些化学试剂，使组织细胞内所含物质尽量保持在生活状态时的形态结构和位置的过程，称为固定。所使用的化学试剂称为固定液。(一)固定目的1．防止自溶和腐败2．凝固或沉淀细胞内物质3．硬化组织4．增加组织的折光率，对染料产生不同亲和力，染色后便于区分。

(二)固定方法常用固定方法有以下几种：1、

浸泡固定法

2

、注射、灌注固定法3

、微波固定法4

、蒸气固定法(三)常用固定液一种好的固定液，应具有以下特性：①渗透力强，能迅速渗入组织内部；②不会使组织过度收缩或膨胀；③能硬化、固化组织；④使组织对染料产生较强的亲和力，并产生较佳的折光率。1、单纯固定液

指由一种化学物质组成的固定液。此类固定液包括：重铬酸钾、苦味酸、丙酮、氯化汞、铬酸、锇酸等。(1)甲醛

为一种可溶于水的无色气体，极易挥发，有强烈的刺激性气味。

不能沉淀白蛋白和核蛋白，但能与蛋白质结合。对染色体、线粒体、高尔基体有良好固定作用，又是糖的保护剂。

市售为37％～40％的甲醛水溶液（福尔马林），用于固定的甲醛溶液浓度为4％，是40％甲醛溶液和水按1：9比例配制而成。甲醛色素甲醛溶液固定的组织时间较长时，因酸化作用而使细胞核着色欠佳，含血较多的组织可形成黑色或黑褐色的色素，即甲醛色素。甲醛色素可用加入适量氨水的75%乙醇处理去除。(2)乙醇

用于固定的浓度以80％～95％最好。

渗透力弱，固定慢。不能固定脂肪、类脂。

不能与氧化剂（如重铬酸钾）混合使用。(3)乙酸(醋酸、冰醋酸)具有刺激气味的无色液体。

组织膨胀作用明显，一般不单独使用。常与乙醇配制成混合固定液，以抵消乙醇所致的组织收缩和硬化。(4)铬酸

三氧化铬的水溶液，具有强酸性及腐蚀性，剧毒，为强氧化剂。

固定核蛋白效果好，可保存糖类。对脂肪无固定作用。

固定后，组织易收缩。

需避光保存。(5)锇酸

即四氧化锇，剧毒，常温可挥发。强氧化剂。

多用于电镜制片的固定，适用于小块组织。

对细胞核、细胞质、尤其是线粒体、高尔基复合体固定良好，也是脂肪和类脂质的固定剂。

配置好的储备液需置于暗处冷藏保存。(6)重铬酸钾

橘红色结晶，有毒，强氧化性。

可使蛋白质变为不溶，对细胞质固定效果好，且能固定类脂质，所以对线粒体和高尔基体固定效果好。（7）丙酮

穿透速度很快，适用于磷酸酶、脂酶及氧化酶的固定。对糖原无固定作用。2、混合固定液

由多种化学物质混合组成的固定液。

实际工作中多使用混合固定液，其固定效果明显优于单纯固定液。(1)中性甲醛液

渗透力强、组织收缩小、染色效果好。

可用作常规固定液或标本保存液。是免疫组化最常用的固定液。固定时间一般为6～24h。配方：40％甲醛150～200ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠13g蒸馏水800～850ml(2)乙醇-醋酸-甲醛液(AAF液)AAF液由对组织渗透速度快的乙醇(alcohol，A)、醋酸(aceticacid，A)和甲醛(formalin，F)三种固定液混合而成。

避免了三种固定液单独使用引起的组织收缩或膨胀，是一种优良的混合固定液。

配方：95％或无水乙醇85ml醋酸5ml40％甲醛10ml(3)乙醇-甲醛液(AF液)由乙醇(alcohol，A)和甲醛(formalin，F)混合而成。配方：95％或无水乙醇90mL40％甲醛10mL(4)Carnoy固定液

配方：无水乙醇60mL

氯仿300mL

冰醋酸10mL穿透力强，适用于糖原及尼氏小体的固定，对染色体固定效果佳，但不适合脂肪固定。（5）Orth固定液

用于胚胎组织、神经组织和脂肪组织的固定。

常需现用现配，且需在暗处固定。常用固定液甲醛乙醇乙酸中性甲醛Bouin液Zenker液成分4%80-95%0.3-5%40%甲醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、水苦味酸-甲醛-醋酸重铬酸钾-氯化汞-醋酸-水渗透力强较弱强强强较强组织收缩（膨胀）收缩小收缩大膨胀小收缩小—硬化组织较好强—较好——优势应用广泛薄标本染色体固定最佳诊断病理学最常用固定剂适用多种组织，胞核着色鲜明适用于一般组织（需含血少）不足可产生甲醛色素固定速度慢对糖、脂肪、类脂无作用—有毒、组织呈黄色需脱汞、避免接触金属、昂贵附：部分物质的理化性质氯化汞：俗称升汞，呈白色结晶性粉末、有剧毒。对脂类、糖固定效果差。常需脱汞处理。苦味酸：黄色针状或块结晶，有毒，爆炸点：300℃。难溶于冷水。易溶于热水。溶于乙醇。(四)固定的注意事项1．及时固定标本应新鲜，取材要及时。

取材后立即将组织块放人固定液中，若固定太迟（如夏天超过4h，冬天超过24h)，组织会干涸、自溶、腐败。左图：瓶口及容器太小右图：合适的容器（容器及瓶口宜大）

2．固定容器宜大3．固定液应足量固定液的量一般为被固定组织体积的10～20倍，贵重的固定液不少于3～5倍。4．固定时间

固定时间应依据组织块的大小、薄厚以及固定液的种类、环境温度而定。组织块大小为(1.0～1.5cm)×1cm×(0.2～0.3)cm时，固定时间以12～24h为宜。有腔器官的固定5．防止组织变形（五）固定后洗涤(1)洗涤的概念用水或乙醇等，将组织经过固定处理后，未与组织结合的固定液及沉淀物清洗掉的过程，称为洗涤。（2）洗涤的目的

洗涤的目的是为了去掉未与组织结合的固定液及沉淀物。（3）洗涤的方法(A)含水固定液的洗涤方法甲醛溶液，用自来水冲洗即可。