(3.1)-免疫组化技术病理检验技术

免疫组织化学技术

常规HE染色能对细胞层面的进行观察，如何进行分子层面的检测？问题第一节概述

应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子进行原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学技术（IHC）或免疫细胞化学技术（ICC）。

免疫组化技术分类(一)按标记物的不同分类1．免疫荧光细胞化学技术2．免疫酶细胞化学技术3．亲和免疫细胞化学技术4．免疫胶体金-银化学技术(二)按染色方法分类1．直接法2．间接法3．桥连法(多步或多层法)4．双标记或多重标记法第二节免疫酶组织化学技术一、基本原理预先将抗体与酶联结，制成酶标抗体，再利用酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，然后借助光镜或电镜进行观察，以对细胞内或细胞表面的抗原或抗体进行定位。

★该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。★酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。二、标记酶选择标准

★酶易于纯化，获得纯制品。★酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。★酶在PH中性液内较稳定。★组织中不应存在与底物作用的内源性酶。

常用的标记酶1、辣根过氧化物酶2、碱性磷酸酶3、葡萄糖氧化酶（一）辣根过氧化物酶（HRP）

HRP的底物为低浓度的H2O2和DAB（二氨基联苯胺）。

组织穿透能力较弱内源性AKP较高左旋咪唑具有抑制作用

、（二）碱性磷酸酶（AKP）

三、染色方法（一）直接法直接法特点及应用1、操作简便、快速、特异性强、非特异性背景反应低等优点，2、常应用于检查肾活检标本中的抗体或补体成分，亦用于系统性红斑狼疮等结缔组织疾病的检查。（二）间接法（重点、难点）

间接法特点及应用

1、对于同一种属动物不同种类的第一抗体，只要用一种酶标抗体就能显示不同特异性抗原的存在。2、间接法与直接法相比更具有实用性，在酶标抗体染色中最为常用。抗体（三）PAP法PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为桥将PAP复合物连接在第一抗体上。（四）亲和免疫组织化学技术1.ABC技术生物素：维生素H，一种小分子的维生素。抗生物素：亲和素或卵白素，一种碱性蛋白。抗生物素与生物素具有极高的亲和力。（生物素）（抗生物素）2、SP法

链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法。其染色原理和操作步骤与ABC法相同，只是用链霉菌抗生物素蛋白代替了ABC复合物中的抗生物素。SP法原理四、免疫组化技术的特点(一)特异性强(二)敏感性高(三)方法步骤统一(四)定位、定性和定量相结合

五、免疫组化的应用(一)生物医学研究1.了解组织细胞的类型和功能2.测定细胞增殖活性和凋亡（二）临床病理诊断（三）对治疗和预后的指导第三节免疫组化技术过程及问题一、组织处理（一）取材（二）固定一般都是用4％中性甲醛液。

注意：固定时间不宜过长（8-24小时），否则，随固定时间的延长，组织抗原的检出率会逐渐下降。（三）脱水、透明、浸蜡二、组织制片1、载物片的处理

（1）多聚左旋赖氨酸法（2）明胶硫酸铬钾法

（3）3-氨丙基-乙氧基甲硅烷(APES)法2、切片三、染色步骤及注意事项染色步骤见视频教学。

(一)抗原修复

目的

甲醛在固定组织时会封闭部分抗原决定簇，在染色时，有些抗原需要先进行修复或暴露，以利抗原抗体最大限度地结合，增强特异性染色。抗原修复方法

1．胰蛋白酶法主要用于细胞内抗原的修复。一般使用的浓度为0.1％(0.1g胰蛋白酶加入pH7.8的0.1％无水CaCl2水溶液中溶解即可)，37℃，作用20～40min。2．胃蛋白酶法

主要用于细胞间质和基底膜抗原的修复。一般使用的浓度为0.4％(0.4g胃蛋白酶溶于0.1mol/L盐酸水溶液中)，37℃，作用30min。3．热诱导的抗原修复(HIAR)

对核抗原的修复作用尤其明显。方法：(1)水浴加热法(2)微波加热法(3)高压加热法注意（1）防止切片的干燥（2）加热要达到规定的温度（3）保温时间要足够

(二)去除内源性酶及内源性生物素1．去除内源性酶

使用H2O2可以去除大部分内源性酶。

注意

（1）H2O2浓度不能过高，一般为3％；（2）作用时间不宜过长，最好室温10min。2．去除内源性生物素方法：染色前，用0.01％抗生物素溶液在室温下处理切片20min。

3．灭活内源性碱性磷酸酶方法：将左旋咪唑(24mg／mL)加入pH在7.6～8.2之间的底物液中，能除去大部分内源性碱性磷酸酶。(三)抑制非特异性背景着色方法：常用的是2％～10％羊血清或2％牛血清白蛋白，在室温下作用10～30min。注意：此种结合是不牢固的，所以不要冲洗，倾去余液后直接加一抗。

(四)缓冲液

抗原抗体反应最合适的pH为7.2～7.6。

最常用的缓冲液是0.01mol／LpH为7.4磷酸盐缓冲液(PBS)。

(五)抗体的选用、分装、稀释及保存1．抗体的选用多克隆抗体单克隆抗体抗原专一较差强非特异性反应较明显较少价格低廉昂贵效价较高较低稀释度1：100～1：10001：50～1：1002．抗体稀释(1)影响抗体稀释度的因素

①抗体的浓度(滴度)②抗体溶液中非特异性蛋白的含量③孵育时间④染色方法(2)抗体最佳稀释度的测定方法(六)孵育方法及时间

抗体孵育应在特制的湿盒内进行。孵育时间常为1h左右，孵育温度为室温或37℃。也可在4℃冰箱过夜。(七)显色

必须在显微镜下严格控制，以检出物显色最强而背景不显色为最终点。

注意：DAB配制好后应在30min内使用，而其作用时间不宜超过10min(最好在5min以内)，不管是否阳性都应及时终止反应。

四、其他常见问题(一)对照片的设置没有对照的免疫组化结果是毫无意义的。只有进行对照，才能排除假阳性和假阴性。常用对照1、空白对照

第一抗体由PBS取代，结果应为阴性；

2、阴性对照

用已知抗原阴性的标本与待检标本同时染色

3、阳性对照

用已知含有待检测抗原的切片与待检标本同时染色(二)结果的判断方法一：以检测结果阳性细胞指数来定性。方法二：以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定。一般地，阳性细胞数少于25为阴性，25～50为+，50～75为++，多于75为+++。(三)常见问题及原因1．假阳性的原因

(1)发生交叉反应（多克隆抗体）

(2)抗体浓度过高

(3)组织对抗体的非特异性吸附(4)内源性酶的作用(5)判断失误(6)外源性和内源性色素的干扰

2．假阴性的原因(1)待测抗原已被分解破坏或抗原含量过低(2)抗体稀释不当，浓度过低(3)抗体失活或效价过低，敏感性差(4)抗体孵育时间过短(5)切片未放入湿盒内