生物制品硫代硫酸盐测定指南（试行）

生物制品硫代硫酸盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗（病毒类灭活疫苗、重组蛋白疫苗、多糖结合疫苗等）、抗血清、重组治疗性蛋白、血液制品、生物制品生产用辅料中硫代硫酸盐的含量测定及生产过程残留量检测。其中碘量法适用于硫代硫酸盐含量≥10mg/L的样品检测（如添加硫代硫酸盐作为抗氧剂的制剂、辅料的含量测定），离子色谱法适用于硫代硫酸盐含量≥0.05mg/L的样品检测（如生产过程中硫代硫酸钠作为中和剂、灭活终止剂的残留量检测）。本指南为试行版，各检验机构可根据样品基质特性优化前处理及检测参数，优化后的方法需通过完整方法学验证后方可投入使用。2方法原理2.1碘量滴定法在酸性条件下，硫代硫酸根与过量碘标准溶液发生定量氧化还原反应：I₂+2S₂O₃²⁻=2I⁻+S₄O₆²⁻，剩余的碘用硫代硫酸钠标准溶液滴定，以淀粉为指示剂，滴定至蓝色完全消失为终点，根据空白与样品消耗的硫代硫酸钠标准溶液体积差计算样品中硫代硫酸盐含量。2.2离子色谱法样品经前处理去除蛋白、多糖等大分子基质后，经阴离子交换色谱柱分离，抑制型电导检测器检测，以保留时间定性，外标法定量。硫代硫酸根为阴离子，在阴离子交换柱的保留时间随淋洗液离子强度升高而缩短，通过优化淋洗液梯度可实现与其他共存阴离子（氯离子、硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、硫氰酸根等）的完全分离。3试剂与材料3.1通用要求试验用水应符合GB/T6682规定的一级水（电阻率≥18.2MΩ·cm），所有试剂应为优级纯及以上级别，硫代硫酸盐标准品应使用有证标准物质，纯度≥99.5%，可溯源至国家或国际标准物质。3.2碘量法试剂3.2.1碘标准储备液（0.05mol/L）：称取13.0g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释至1000mL，摇匀，储存于棕色试剂瓶中，避光密封保存，每月用硫代硫酸钠标准溶液标定浓度。3.2.2硫代硫酸钠标准储备液（0.1mol/L）：称取26g硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃·5H₂O），溶于1000mL水中，缓缓煮沸10min，冷却，加0.2g无水碳酸钠作为稳定剂，放置2周后过滤，按《中华人民共和国药典》通则规定标定浓度。3.2.3淀粉指示剂（10g/L）：称取1.0g可溶性淀粉，加10mL水调成糊状，边搅拌边加入90mL沸水，煮沸2min至完全透明，冷却后取上清液使用，现配现用，如需长期保存可添加0.1g碘化汞作为防腐剂，有效期7天。3.2.4乙酸溶液（0.5mol/L）：量取28.6mL冰乙酸，加水稀释至1000mL。3.2.5三氯乙酸溶液（150g/L）：称取15g三氯乙酸，加水溶解并稀释至100mL，4℃保存。3.2.6甲醛溶液（40%）：分析纯，避光保存。3.2.7丙酮：分析纯，不含还原性物质。3.3离子色谱法试剂3.3.1淋洗液：根据色谱柱类型选择，碳酸盐体系为4.5mmol/LNa₂CO₃+0.8mmol/LNaHCO₃混合溶液，氢氧根体系为20mmol/LKOH溶液（梯度洗脱时按需调整浓度），淋洗液需经0.22μm滤膜过滤，超声脱气20min后使用。3.3.2抑制器再生液（50mmol/LH₂SO₄）：量取2.8mL浓硫酸，缓缓注入1000mL水中，冷却后摇匀。3.3.3硫代硫酸盐标准储备液（1000mg/L，以S₂O₃²⁻计）：准确称取0.2214g预先经硅胶干燥至恒重的硫代硫酸钠标准品，加少量水溶解，加入0.1g无水碳酸钠，定容至100mL，棕色瓶4℃避光保存，有效期3个月。3.3.4硫代硫酸盐标准工作液：临用前将标准储备液用水逐级稀释，配制成0.05、0.1、0.5、1、5、10、20mg/L的系列标准溶液，现配现用。3.4材料3.4.1碘量瓶（250mL）、A级棕色滴定管（5mL、10mL）、容量瓶（10mL、50mL、100mL）。3.4.20.22μm水系微孔滤膜、10kD超滤离心管、OnGuard系列固相萃取小柱（H柱、Ag柱、C18柱）。3.4.3高纯氮气（纯度≥99.999%）。4仪器设备4.1碘量法仪器：分析天平（感量0.1mg）、磁力搅拌器、高速离心机（最高转速≥12000r/min）、pH计（精度±0.01）。4.2离子色谱法仪器：离子色谱仪（带阴离子抑制型电导检测器）、阴离子交换色谱柱（推荐DionexIonPacAS19/AS23柱或同等性能色谱柱，配套对应保护柱）、柱温箱（控温精度±0.1℃）、数控超声仪、氮吹仪。5样品前处理所有样品采集后需避光、4℃密封保存，前处理需在2h内完成，避免硫代硫酸根氧化降解，前处理过程同步制备试剂空白和基质空白。5.1碘量法前处理5.1.1高含量辅料/制剂样品：准确移取2.0~5.0mL样品，加水稀释至50mL，加乙酸溶液调pH至4.5~5.5，待滴定。5.1.2含蛋白生物制品样品：准确移取5.0mL样品，加入等体积150g/L三氯乙酸溶液，涡旋混匀1min，4℃静置15min，12000r/min4℃离心15min，取全部上清液，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.5~5.5，定容至50mL，待滴定。5.1.3干扰消除：①含亚硫酸盐样品：加入1mL40%甲醛溶液，混匀后避光静置10min，消除亚硫酸盐干扰；②含抗坏血酸样品：加入等体积丙酮，混匀后避光静置30min，消除抗坏血酸干扰；③含巯基化合物样品：加入1mL0.1mol/LN-乙基马来酰亚胺溶液，静置15min，消除巯基干扰。5.2离子色谱法前处理5.2.1重组蛋白/血液制品：准确移取1.0mL样品，加入1mL150g/L三氯乙酸溶液，涡旋混匀，4℃静置15min，12000r/min离心15min，取上清液用10mol/L氢氧化钠调pH至7.0±0.5，依次过OnGuardH柱、C18柱，弃去前3mL流出液，收集后续流出液，过0.22μm滤膜后进样。5.2.2灭活病毒疫苗：准确移取2.0mL样品，加入0.5mL40%甲醛溶液消除亚硫酸盐干扰，用10kD超滤管8000r/min4℃离心20min，收集滤过液，若样品氯离子浓度高于1000mg/L，需再过OnGuardAg柱除氯，过0.22μm滤膜后进样。5.2.3多糖/多糖结合疫苗：准确移取1.0mL样品，加入4mL无水乙醇，涡旋混匀，4℃静置30min沉淀多糖，10000r/min离心10min，取上清液氮吹至1mL，过C18柱，收集流出液过0.22μm滤膜后进样。6测定步骤6.1碘量法6.1.1碘标准溶液标定：准确移取25.00mL0.05mol/L碘标准储备液至250mL碘量瓶中，加100mL水，用0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至溶液呈浅黄色，加入1mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色完全消失，30s内不返蓝为终点，同时做空白试验。碘标准溶液浓度计算公式为：c(I₂)=[c(S₂O₃²⁻)×(V₁-V₀)]/(2×25.00)式中：c(I₂)为碘标准溶液浓度，mol/L；c(S₂O₃²⁻)为硫代硫酸钠标准溶液浓度，mol/L；V₁为滴定碘溶液消耗的硫代硫酸钠体积，mL；V₀为空白试验消耗的硫代硫酸钠体积，mL。6.1.2样品测定：将处理好的样品溶液置于250mL碘量瓶中，准确加入过量10%~20%的碘标准溶液，密塞，避光摇匀后放置10min，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，加1mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色完全消失，30s不返蓝为终点，同步做空白试验。6.1.3结果计算：ρ(S₂O₃²⁻)=[c(S₂O₃²⁻)×(V₀-V₂)×112.13×1000]/V_s×f式中：ρ(S₂O₃²⁻)为样品中硫代硫酸盐含量，mg/L；V₀为空白消耗硫代硫酸钠体积，mL；V₂为样品消耗硫代硫酸钠体积，mL；112.13为硫代硫酸根摩尔质量，g/mol；V_s为取样体积，mL；f为样品稀释倍数。6.1.4检出限：本方法检出限为5mg/L，定量限为10mg/L。6.2离子色谱法6.2.1色谱条件：采用DionexIonPacAS19阴离子交换柱（250mm×4mm），配套AG19保护柱（50mm×4mm），柱温30℃，流速1.0mL/min，淋洗液为KOH梯度洗脱：0~10min10mmol/L，10~20min10~40mmol/L，20~25min40mmol/L，25.1min切换为10mmol/L平衡5min；抑制器为ASRS3004mm，抑制电流112mA，进样量25μL。上述条件下硫代硫酸根保留时间约为18.2min，与相邻阴离子分离度≥1.5。6.2.2标准曲线绘制：将系列浓度标准工作液按浓度由低到高依次进样，每个浓度重复进样3次，以平均峰面积为纵坐标，对应硫代硫酸根浓度为横坐标绘制标准曲线，要求线性相关系数r≥0.999。6.2.3系统适用性试验：取1mg/L标准溶液连续进样6次，硫代硫酸根保留时间RSD≤1.0%，峰面积RSD≤2.0%，理论塔板数≥5000，拖尾因子0.9~1.2为系统合格。6.2.4样品测定：处理好的样品溶液进样，记录色谱图，保留时间定性，外标法定量，每进样10个样品插入1个中间浓度标准溶液校准，偏差≤2%时数据有效。6.2.5结果计算：将样品峰面积代入标准曲线回归方程，得到样品溶液中硫代硫酸根浓度，乘以稀释倍数得到样品中实际含量。6.2.6检出限：本方法检出限为0.01mg/L，定量限为0.05mg/L。7干扰与消除7.1碘量法干扰消除7.1.1氧化性物质干扰：样品中含次氯酸根、过氧化氢等氧化性物质时，会氧化硫代硫酸根导致结果偏低，采样后立即加入0.5g碘化钾，密封避光，若溶液变黄则说明存在氧化性物质，通高纯氮气10min将析出的碘完全赶出后再进行前处理。7.1.2高浓度蛋白干扰：蛋白会包裹碘单质导致终点模糊、结果偏高，需通过三氯乙酸、钨酸钠沉淀或超滤完全去除蛋白，滴定前若溶液浑浊需再次离心取上清液。7.2离子色谱法干扰消除7.2.1高浓度氯离子干扰：氯离子浓度≥1000mg/L时会产生强拖尾峰，覆盖硫代硫酸根峰，可通过稀释样品、使用高容量阴离子交换柱或过OnGuardAg柱去除氯离子，经Ag柱处理后硫代硫酸根回收率≥90%。7.2.2共存阴离子干扰：亚硫酸根、硫氰酸根与硫代硫酸根保留时间接近，通过优化淋洗液梯度可将分离度提升至1.5以上，如无法分离可在中性条件下加入0.1mL3%过氧化氢，静置5min将亚硫酸根氧化为硫酸根，对硫代硫酸根回收率影响≤5%。7.2.3基质污染干扰：蛋白、多糖等大分子残留会污染色谱柱，导致柱压升高、分离度下降，前处理需完全去除大分子，每次试验结束后用100mmol/LKOH冲洗色谱柱30min，再用10mmol/LKOH平衡保存。8方法学验证要求本方法用于生物制品质量控制检验前，需完成以下方法学验证：8.1专属性：空白基质色谱图中无硫代硫酸根特征峰，待测峰与相邻杂质峰分离度≥1.5，加标样品中硫代硫酸根回收率符合要求。8.2线性与范围：线性相关系数r≥0.999，线性范围需覆盖待测样品限度的80%~120%，残留检测需覆盖定量限至限度的200%。8.3准确度：采用加标回收法验证，设置低、中、高三个加标浓度（分别为限度的50%、100%、150%），每个浓度平行制备3份，碘量法回收率需在95%~105%之间，RSD≤2%；离子色谱法回收率需在85%~115%之间，RSD≤10%。8.4精密度：重复性要求同一操作人员同一天制备6份平行样品，测定结果RSD≤5%；中间精密度要求不同操作人员、不同日期测定，结果RSD≤10%。8.5耐用性：考察参数微小变化对结果的影响，碘量法考察pH±0.5、反应时间±2min，离子色谱法考察柱温±2℃、流速±0.1mL/min、淋洗液浓度±5%，要求分离度仍≥1.5，测定结果RSD≤5%。9结果判定与报告9.1结果判定：测定结果与对应生物制品的法定质量标准比对，低于或等于限度值为合格，高于限度值为不合格，需重新取样复测。9.2报告要求：报告需注明检测方法、样品编号、批号、前处理方法、标准品来源及批号、方法学验证数据（回收率、精密度）、测定结果（单位为mg/L，保留3位有效数字，低于定量限则报告<定量限值），并附检验人、复核人签字及检验日期。10生物安全与废弃物处理10.1生物安全：涉及活病毒疫苗、血液制品等具有潜在生物危害的样品，前处理需在二级生物安全柜内进行，操作人员需穿戴防护服、手套、护目镜，避免样品接触皮肤黏膜。10.2废弃物处理：实验后剩余的生物样品、一次性耗材（离心管、滤膜、固相萃取小柱）需经121℃高压灭菌30min后按医疗废弃物处置；含碘、酸、碱的废液需分类收集，中和至pH6~9后排放，含重金属的废液需交由有资质的危废处理机构处置。11注意事项11.1硫代硫酸钠标准溶