基因工程载体噬菌体载体

基因工程载体噬菌体载体基因工程载体噬菌体载体第1页2噬菌体载体（phagevectors)一、噬菌体载体二、单链噬菌体载体三、噬菌粒载体四、柯斯质粒载体基因工程载体噬菌体载体第2页一、噬菌体载体基因工程载体噬菌体载体第3页噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage)（一)噬菌体普通特征结构：

蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等)。

基因工程载体噬菌体载体第4页基因工程载体噬菌体载体第5页T4Bacteriophage基因工程载体噬菌体载体第6页71.噬菌体生物学特征溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化,然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒组装,最终使寄主细胞破裂而释放出大量子代噬菌体。溶源周期中,注入寄主细胞噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并能够伴随寄主细胞分裂而进行复制。整合了一套完整噬菌体基因组细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在整合或非整合噬菌体DNA被称为原噬菌体。

噬菌体温和噬菌体,含有溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体,只含有溶菌生长周期基因工程载体噬菌体载体第7页分为两种:（1)溶菌周期：噬菌体生活周期烈性噬菌体(virulentphage)基因工程载体噬菌体载体第8页基因工程载体噬菌体载体第9页（2)溶原周期：感染细菌后,将自己DNA整合到细菌染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化温和噬菌体(temperatephage)基因工程载体噬菌体载体第10页基因工程载体噬菌体载体第11页2、

噬菌体结构和其核酸类型：

结构：无尾部结构二十面体型、

具尾部结构二十面体型、

线状体型

核酸类型：最常见是双链线性DNA.

双链环形DNA.

单链环形DNA.

单链线形DNA.

单链RNA。

基因工程载体噬菌体载体第12页

3.λ-DNA物理图谱

λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸互补单链（粘性末端)GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。特点是功效相近基因在基因组中聚集在一起。

基因工程载体噬菌体载体第13页λ噬菌体

组成特点:

双链线状DNA分子，

全长50kb，

含65个基因，

在其分子两端各含有12个碱基互补单链，是天然粘性末端，被称为COS位点。

基因工程载体噬菌体载体第14页λ噬菌体感染细菌后溶菌性生长和溶源性生长

溶菌性生长（lyticpathway)

噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来噬菌体又可感染其它细菌。

溶源性生长(lysogenicpathway)

噬菌体感染细菌后，可将本身DNA整合到细菌染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解

。

基因工程载体噬菌体载体第15页

噬菌体

AWBDEFZ

JattxisNclcroOPQSR

结构区

重组区调控区裂解区cos位点

cos

位点ARAREcoRI目标基因EcoRIEcoRI插入型置换型基因工程载体噬菌体载体第16页基因工程载体噬菌体载体第17页AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS

头部基因尾部基因功效不明区

溶源化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必须区段cI基因:溶源过程控制基因。

λ噬菌体基因组结构基因工程载体噬菌体载体第18页 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephage

cosendsCircularformLinearform基因工程载体噬菌体载体第19页（二)λ噬菌体载体主要类型

（1)插入式载体

一个只含有一个可供外源DNA插入克隆位点

派生载体。

（2)替换型载体（取代型载体)

含有成正确克隆位点，在这

两个位点之间λDNA区段能够被外源插入DNA片段所取代。

（3)凯伦噬菌体载体基因工程载体噬菌体载体第20页基因工程载体噬菌体载体第21页（2)λ替换型载体（取代型载体)外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体感染和复制非必要片段(~20kb)高感染效率(109

转化株/ug载体DNA,比质粒高100-倍)e.g.EMBL3,

DASH基因工程载体噬菌体载体第22页替换式载体

野生型噬菌体染色体中段对于噬菌体感染和复制是非必要，外源DNA能够取代这一片段，比如Charon4A.λEMBL3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac5（乳糖操纵子大个别系列，包含完整LacZ）替换入噬菌体中间区段，同时将Lac5作为选择标识，使用时用EcoRI水解，去掉中间片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。换型噬菌体λ是使用最广泛载体。

基因工程载体噬菌体载体第23页基因工程载体噬菌体载体第24页（3)凯伦噬菌体载体现有插入型；又有替换型在基因工程试验中用途十分广泛承受外源DNA能力：几个kb到23kb基因工程载体噬菌体载体第25页（左右臂连接)（三段本身连接)（插入片段)基因工程载体噬菌体载体第26页（三)体外包装

λ噬菌体DNA体外重组后，普通必须经过体外包装，然后以噬菌体感染方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞频率可达106~108/μgDNA，而以转染（translation)方式导入频率仅为103~105/μgDNA。

λ噬菌体包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5kb)75%~105%。

基因工程载体噬菌体载体第27页

因为λ噬菌体包装时，当DNA长度短于野生型78%或超出105%时，噬菌体活性就急剧下降。所以只包装它野生型DNA（48.5KB）75%~105%左右ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。插入式载体可携带外源ＤＮＡ片段较替换式为小。

基因工程载体噬菌体载体第28页◆λ噬菌体载体可接收15kb-23kb外源DNA片段,它既可作为克隆载体,也可作为表示载体,广泛用于各类基因库构建。

基因工程载体噬菌体载体第29页筛选标识:蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。

重组噬菌体分子量必须在野生型噬

菌体

分子量大小75%至105%之间。

用途:b.用于构建基因组或cDNA文库。c.用于抗体库或随机肽库构建。a.用作普通克隆载体。基因工程载体噬菌体载体第30页（四)λ-DNA抽提

大肠杆菌培养至对数生长久2)加入λ-噬菌体或重组λ-噬菌体悬浮液,37℃培养1hr3)用新鲜培养稀释,继续培养4-12hr4)高速离心,沉淀噬菌体5)苯酚抽提,释放λ-DNA6)乙醇或异丙醇沉淀DNA基因工程载体噬菌体载体第31页（五)λ-DNA作为载体优点

体外包装病毒颗粒,高效感染E.coli2)装载外源能力为25kb,大于质粒3)筛选方便4)重组λ-DNA分子提取轻易

基因工程载体噬菌体载体第32页二、单链噬菌体载体基因工程载体噬菌体载体第33页（一)单链噬菌体载体M13.f1、fd噬菌体单链环状DNA丝状大肠杆菌噬菌体:M13噬菌体基因工程载体噬菌体载体第34页单链DNA噬菌体载体M13.f1、fd。优越性：1.单链DNA噬菌体复制，是以双链环形DNA为媒介，这种复制形式DNA简称RFDNA；2.不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；3.单链DNA噬菌体颗粒大小，是受其DNA多制约，不存在包装限制

问题；4.轻易测定外源DNA片断插入取向；5.可产生含外源片断单链DNA分子。

基因工程载体噬菌体载体第35页3.M13噬菌体

噬菌体正链复制复制型DNA经pII蛋白造缺口3′5′经pII蛋白剪切释出单链DNA(正链)进入下一循环5′3′3′5′滚环复制在细菌内复制模式图基因工程载体噬菌体载体第36页

M13噬菌体几个主要特点:1.M13噬菌体不溶解宿主细胞,只是降

低宿主细胞生长速度。

2.M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在,所以能够用感染(经包装单链DNA)和转化(双链DNA)。

3.克隆外源基因片段不宜大于1000bp。基因工程载体噬菌体载体第37页M13噬菌体载体

M13是一个含单键（+)DNA（ssDNA)丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来取得大量单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法)、基因定点突变研究、异源双链DNA分析等。

基因工程载体噬菌体载体第38页基因工程载体噬菌体载体第39页M13噬菌体特点感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链复制型ＤＮＡ（replicationformDNA,RFDNA)。能够象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作。

成熟噬菌体颗粒仅能感染E.coliF+细胞，这是因为这种噬菌体感染位点在性散毛上。不过不论是RFDNA或ssDNA都能转染E.coliF+或F-细胞。

噬菌体颗粒大小是受其ＤＮＡ大小制约，这一点恰好与λ噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制问题。

基因工程载体噬菌体载体第40页M13单链DNA噬菌体生命周期基因工程载体噬菌体载体第41页RFDNA基因工程载体噬菌体载体第42页基因工程载体噬菌体载体第43页PhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.基因工程载体噬菌体载体第44页（二)M13载体构建（1)克隆区域选定①

基因间隔区（intergenicregion,IG区)J.Messing证实,IG区存在M13复制起点,但能够插入外源DNA而不影响M13噬菌体活力。

基因工程载体噬菌体载体第45页在IG区内插入一个大肠杆菌LacZ’（-肽序列)。

利用-肽序列中三个单一酶切位点（BglII、AvaII和PvuI)。

(2)加入酶切位点①在IG区内加入单一内切酶位点第一个M13载体:M13mp1:基因工程载体噬菌体载体第46页M13RFBsuI不完全消化各种长度线性片断（其中应有只在IG上切开线性全长M13)E.colilac基因HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ’)连接M13mp1JM101宿主只有在IG区插入lacZ’才能存活并在Xgal上出现互补蓝噬菌斑基因工程载体噬菌体载体第47页（三)M13系列载体优点1)有MCS，便于克隆不一样酶切片段2)Xgal显色反应，可供直接选择3)无包装限制，克隆能力大4)能够克隆双链DNA分子中每一条链子代M13噬菌体中包含是单链+DNA。基因工程载体噬菌体载体第48页基因工程载体噬菌体载体第49页

（四)M13噬菌体用途：1)DNA序列测定；2)制备单链DNA探针；3)用于定点突变研究。

基因工程载体噬菌体载体第50页M13载体

含有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体多克隆位点与质粒载体pUC序列多克隆位点是相同，在克隆位点选择上更为方便。

能够定向地克隆DNA片段，克隆在M13RFDNA分子上双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链形式。所以假如要同时分离ＤＮＡ分子中双链，则需要两种独立克隆。依据M13生物学特征知道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋)链，所以M13载体克隆外源DNA片段在子代噬菌体中终究是含有DNA分子中哪条链，则完全取决于外源ＤＮＡ克隆时取向。这么一来，为分别分离外源ＤＮＡ分子两条链带来一定麻烦，处理这一问题一个行之有效方法就是定向克隆技术。

基因工程载体噬菌体载体第51页M13克隆载体分子结构图基因工程载体噬菌体载体第52页三、噬菌粒载体基因工程载体噬菌体载体第53页噬菌粒载体

由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成新型载体系列。

它含有质粒复制起点、选择性标识、多克隆位点等，方便DNA操作，可在细胞内稳定存在;又含有单链噬菌体复制起点，在辅助噬菌体存在下，可进行噬菌体繁殖，产生单链子代噬菌体。基因工程载体噬菌体载体第54页噬菌粒载体（phagemidvectors)由质粒载体与单链噬菌体载体复制起点结合而成新型载体系列。MCS噬菌体ori质粒oriAmprlacZ’

lacI基因工程载体噬菌体载体第55页约3000bp（比M13小)②克隆能力大能插入10kb外源DNA。③两种复制形式①分子量小1.噬菌粒载体特点既含有质粒复制起点,又含有噬菌体复制起点。

既能在大肠杆菌中以质粒形式双链复制,又能在噬菌体内进行单链复制。

基因工程载体噬菌体载体第56页常见噬菌粒载体pUC118和pUC1191.含有较小分子量共价、闭合、环形基因组DNA，可克隆10kb外源DNA片段，并易于进行分离与操作;2.编码一个ampr基因作为选择记号，所以只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素培养基中生长，便于转化子选择;3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少许大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量载体DNA;4.存在着一个多克隆位点区，所以许各种不一样类型外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上;基因工程载体噬菌体载体第57页5.因为多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因5’-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子;6.lacZ基因是置于lac开启子控制之下，这么插入外源基因便会以融合蛋白质形式表示;7.含有质粒复制起点，在没有辅助噬菌体情况下，克隆外源基因能够像质粒一样按常规方式，复制形成大量双链DNA分子8.带有一个M13噬菌体复制起点，在有辅助噬菌体感染寄主细胞中，能够合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中;基因工程载体噬菌体载体第58页9.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区核苷酸序列取向是彼此相反，于是它们当中一个可转录克隆基因正链DNA，另一个则可转录出负链DNA;10.能够直接对克隆DNA片断进行核苷酸序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体这一烦琐亚克隆步骤。

基因工程载体噬菌体载体第59页基因工程载体噬菌体载体第60页pBluescript噬菌粒载体基础结构：1.在多克隆位点两侧，有一对T3和T7噬菌体开启子，能够定向指导外源基因转录活动;2.同时含有一个单链噬菌体M13或f1复制起点和一个来自ColE1质粒复制起点，在不一样情况下，能够采取不一样复制形式，分别合成单链或双链DNA;3.编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记号;4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。基因工程载体噬菌体载体第61页T7T3用于体外转录基因工程载体噬菌体载体第62页基因工程载体噬菌体载体第63页3PCR产物克隆载体T载体pCR系列载体Invitrogen企业开发线性噬菌粒载体。①结构pUC质粒个别、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。MCS中部已经切开,各有一个3’端突出T。

②特点PCR产物往往在3’端突出一个A,所以能与这个载体直接连接。

基因工程载体噬菌体载体第64页Tvector克隆过程——简便!AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA基因工程载体噬菌体载体第65页基因工程载体噬菌体载体第66页四、柯斯质粒载体基因工程载体噬菌体载体第67页柯斯质粒(cosmid)

一个人工构建克隆载体，包含了λ噬菌体cos基因。柯斯质粒能被包装到λ噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携带入宿主细菌DNA片段（超出45kb)要比质粒载体携带要大基因工程载体噬菌体载体第68页（一)粘粒(cosmid)

组成:2.抗性基因;1.质粒复制起始位点(ORI);3.用于插入目标基因单个酶切位点;4.

噬菌体cos位点。

可见,cosmid是由质粒和噬菌体cos位点构建而成。

基因工程载体噬菌体载体第69页与噬菌体载体和质粒载体相比含有多个优点：（1)含有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠杆菌中实现本身环化，并能在大肠杆菌中复制；（2)有像质粒一样选择标识；（3)cosmid载体比较小，但能插入较大外源片段，可克隆外源片段长度在15~45kb之间。因为cosmid载体大片段克隆能力，多用于基因组文库构建，而λ噬菌体载体多用于cDNA文库构建。已经有各种粘粒载体可用于基因克隆，pJB8是最常见粘粒载体之一（4)各种单一酶切位点，便于克隆

1.粘粒载体优点基因工程载体噬菌体载体第70页柯斯质粒载体特点含有λ噬菌体特征;含有质粒载体特征;含有较高容量克隆能力;含有与同源性序列质粒进行重组能力基因工程载体噬菌体载体第71页

特点:可插入长达27～41kb外源基因,方便地用于克隆大片段DNA。

加入噬菌体头部和尾部蛋白,可将

粘粒包装成类似于噬菌体具感染能力颗粒,方便地进入大肠杆菌。

粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体

功效,而表现质粒特征。

基因工程载体噬菌体载体第72页柯斯质粒载体cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA载体，它是由λ噬菌体cos（cohesive)末端及质粒（plasmid)重组而成载体。cosmid载体带有质粒复制起点、克隆位点、选择性标识以及λ噬菌体用于包装cos末端等，所以该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装特征进行体外包装，利用噬菌体感染方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产