DB51T11852025桑蚕微粒子病诊断防控技术规程

ICSICSCCSB DB51/T1185—DB51/T844—2008，DB51/T1185— 四川省市场监督管理 发布DB51/TDB51/T1185—DB51/TDB51/T1185— 前 范 附录A（资料性）微粒子孢子 附录B（资料性）DNA普通提取 附录C（资料性）荧光定量PCR产物相关信 附录D（资料性）阳性质粒的制 前本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件代替DB51/T844—2008《桑蚕微粒子病防治技术规程》和DB51/T1185—2011《桑蚕微粒子病诊断技术规程》。与DB51/T844—2008和DB51/T1185—2011相比，除结构性调整和编辑性改动外，DB51/T844—2008和DB51/T1185—2011——DB51/T844于2008年首次发布；DB51/T1185于2011DB51/TDB51/T1185—DB51/TDB51/T1185—GB/T6682NY/T1027DB51/T848DB51/T1187桑蚕微粒子病pebrineforsilkwormBombyx补正检查correctiveinspectionfor预知检查predictiveinspectionfor——生化培养箱，温度范围10℃～50——普通冰箱，温度为0～420——电子天平，精度0.001——离心机，转速0r/min～3000r/min——分析用水按GB/T6682——样品袋、离心管（1.8mL、530d～60d。 31r/min离心3min，倾去上清液，沉淀物振荡制成镜检样本，用普通光学显微镜观察。将检出有微粒子孢子的磨碎液吸取1滴，滴于载玻片上，再加1滴～2滴过氧化氢溶液 实时荧光定量PCR——普通冰箱，温度为0～42080——荧光定量PCR仪，温度范围4.0～99.9——高速冷冻离心机，转速为0r/min～16000——微量可调移液器，最大量程分别为2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000——超纯水（Rnase/Dnasefree,——分析用水按GB/T6682提取好的DNA模板保存于-20680——正向引物：5'ACGGAAGAATACCACAAGGAGT——反向引物：5'CACTACATCTGTCTAAATGAGGGTC——探针：5'-FAMCGTTGAGTCAAATTAAGCCGCACATAM-3反应体系20μL：2X探针法qPCRMix10μL，10umol/L正、反向引物各0.4μL，10μmol/L探针0.4μL，DNA模板2μL，超纯水（Rnase/Dnasefree,Sterile）6.8μL。每个样品设3个重复。以含有经4.2.5.1引物扩增的GNL8基因片段的阳性质粒DNA（拷贝数为1.0×103个/μL，制备方法参见附录D）替代DNA模板作为阳性对照；以超纯水（Rnase/Dnasefree,Sterile）代替DNA模板作阴性对照。反应程序：95℃预变性2min；95℃5s，60℃30s（荧光信号在每个循环的此阶段进行），循环10表1死卵，每蛾抽取20粒～30原原种按张平均分为2个样、母种每蛾1不需处置，1张为10.33％的漂白粉液，刷于卵面及蚕连纸正面和10s，取出。DB51/T8486.2DB51/T8486.2.4表2表35min～1010min～155min～105min～10表4每龄每饲育区（原蚕每张或每饲育户采茧时，每饲育区（原蚕每饲育户）不需处置。每2头为1等外的病死蛹的50%不需处置。每1粒～2粒为1原蚕上蔟3d时，每饲育户随机抽取7003080％的条件下保护， 养蚕制种结束后，养蚕相关环境用具应及时全面清洗、消毒。消毒方法按照DB51/T848中6.3的规1％1DB51/T11874、5、6附录A.1附录DNA——普通冰箱，温度为0～42080——高速冷冻离心机，转速为0r/min~16000——微量可调移液器，最大量程分别为2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000——PBS缓冲液[组分：NaCl136.89mmol/L；KCl2.67mmol/L；Na2HPO48.lmmol/L；KH2PO41.76——蛋白酶K[20——Tris饱和酚[10——TEbuffer[10mmol/LTris，1mmol/L——分析用水按GB/T6682取4.2.4.1制备好的样品2.0g，加入500mLPBS缓冲液和5μL蛋白酶K溶液，55℃水浴2h。加入氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），颠倒充分混匀5min，4℃，12000r/min离心10min0.8倍体积的冷冻异丙醇，-80℃沉淀15min。4℃，12000r/min离心10min，小心倾倒上清液；加入600μL冰乙醇[w(CH3CH2OH)=75DNA5min，min将DNA再洗一次，12000r/min离心2min，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上，数分钟后直立离心管，自然风干。加入100μLTEbuffer（pH8.0）溶解DNA，在37℃金属浴中保温30min；使DNA浓度稀释至100ng/μL以内作为附录家蚕微孢子虫GNL8rRNA基因，GenBankMT510146.1（745~928）扩增产物大小为183bp附录以桑蚕微孢子虫DNA为模板，用GNL8rRNA基因的正向引物和反向引物扩增目的基因片段，PCR反应DNA模板，Taq酶（5U/pL）0.5μL，超纯水（Rnase/Dnasefree,Sterile）20.3μL。反应条件为：94℃预变性2min；94℃30s，55℃40s，72℃