aptamer introduction核酸适配体的介绍

1、核酸适配体的简单介绍,研究背景,肿瘤的检测，成像和靶向治疗的关键是发展特异性的分子探针,定义：核酸适配体是从DNA/RNA文库中筛选得到的、能够高亲和性和高特异性地与靶标结合的单链寡核苷酸，由于它折叠后形成的特定的三维结构能与生物靶标如蛋白质结合，因此近年来迅速发展成为在疾病基础研究及诊断治疗中具有广泛应用前景的新技术。,与目前在生物医学领域中广泛应用的抗体相比，核酸适配体是一种全新的分子识别方法，它与靶标结合的特异性和亲和力与抗体相当甚至更强，而且具有合成简单快速；适用范围广，易于进行化学修饰和多功能化，组织穿透性好，有望直接运用于活体分子成像和药物传输；且其具有免疫原性小、稳定性好等优点。

2、与反义核酸、干扰RNA等基因药物相比，核酸适配体作为药物或靶向药物载体具有更为普遍的适用性,“Aptamer”: Latin word “aptus” 适合 + Greek word “meros” 粒子,1.1 新型分子探针核酸适体 (aptamer),核酸适体：能高亲和性结合靶分子的20-50碱基的寡聚核苷酸,Clin. Chem., 1999, 45：1628-1650; Biolmol. Eng., 2007, 24: 381-403,1.1.1 核酸适体的优点,1.1.2 核酸适体与靶标的作用基础,通过碱基对堆积作用、氢键、静电和疏水等作用协同作用,SELEX技术路线图,核酸文库构建

3、 筛选 分离和回收 聚合酶链扩增,1.2 指数富集配体系统进化技术（SELEX）,Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment,Annual Review of Medicine, 2005, 56: 555-583,SELEX本质上是体外模拟自然进化的一种定向进化技术。其基本原理是构建随机单链寡核苷酸文库，然后根据核酸序列对特定靶分子的亲和性，通过重复将核酸序列与靶分子相互作用、洗脱和聚合酶链扩增与靶分子结合的核酸序列三个基本步骤，在很短的时间内得到符合特定要求的核酸适体。,分离：对蛋白质靶分子来说，通常利用硝酸纤维素膜过

4、滤法、变性凝胶电泳法、亲和层析、毛细管电泳等方法来分离与蛋白结合的寡核苷酸。,1.2.1 核酸文库的构建,固定序列,固定序列,随机碱基序列（N）,库容量：理论库容量为4N；实际文库库容量：1014 1015,RNA/DNA文库:,固定序列碱基数目：18-21 nt；随机碱基数目：30-60 nt,理论上，任何物质都能成为核酸适体的筛选靶标,在筛选实验中，DNA和RNA核酸适体在亲和性和特异性方面并没有差异，但是在其它方面各具有各自的优点。如RNA核酸适体具有容易获得和在细胞内表达等优点，但是由于DNA的稳定性使得DNA文库更广泛用于SELEX实验中。,1.2.2 核酸文库的种类,（1）结构限制

5、性文库（structurally constrained library）：将随机碱基置于能形成特定二级结构（如发夹、G-四面体或假结等二级结构）的固定序列中。当知道靶标分子优先结合某种特定的结构蛋白时或增加所选择的核酸适体的稳定，这时可以在筛选试验中引进结构限制性文库，以达到快速得到具有某种功能产物的目的。 （2）掺杂文库（doped library） ：掺杂文库中的随机序列是由已知序列（如已知的核酸适体）组成，但在合成这个区域的每个碱基时，通过加入1-33%的其它三种核苷酸，合成在一定程度上与已知的序列相似，但又存在一些变异体的文库。掺杂文库不但可以用来考察已知核酸适体能与靶标分子作用的不

6、同突变序列，还可以用来优化已知的核酸适体序列和确定它与靶分子相互作用的核心碱基。 （3）无固定序列的文库（library free of fixed sequences：在一些筛选实验中，文库两端的固定序列可参与了核酸适体的识别，它们的删减往往会减弱核酸适体的结合作用。但在有些筛选中，固定序列也可能与中间的随机序列形成一些二级结构从而干扰核酸适体的筛选。因此，在得到核酸适体序列后还需要进一步的截短实验来确定核酸适体的核心序列。 （4）基因组文库（genomic library)：指在基因组中某段感兴趣的核酸序列（50-500碱基）两端引入用于PCR扩增的固定序列。,1.2.3 核酸适体靶分子的

7、多样性,简单体系,复杂体系,1.2.2 提高核酸适体选择性的筛选方法,（1）负筛选(negative selection)是指通过一定方法排除固定靶标所用的基质对筛选过程的干扰，使获得的核酸适体仅针对目标分子。,这种方法最早是由Ellington研究小组41在针对有机染料小分子筛选时提出来的，在前三轮筛选的文库对靶分子不具有选择性（文库中能与小分子结合的DNA比例小于0.1%），但是在第四轮之前加入负筛选，文库中能与小分子结合的比例达到了9.4。这一结果充分证明了负筛选在实际筛选应用中的意义。,（2）反向筛选（counter selection）是为了获得专一性更强的核酸适体而提出的，主要是通

8、过一些方法去除能结合与靶分子类似物质的核酸序列。这种方法首先在筛选茶碱核酸适体的实验中使用。 Jenison等人利用与茶碱结构仅差一个甲基的咖啡因作为反向靶标对茶碱进行筛选，获得了只结合茶碱而与咖啡因不结合的核酸适体。 Science, 1994, 263: 1425-1429 Ito等人利用三碘甲腺原氨酸作为反向筛选物质，获得能特异识别四碘甲腺原氨酸的核酸适体。 Methods, 2000, 22: 107-114,（3）消减筛选法（subtractive SELEX）是为了在复杂体系中扣除复杂体系中非靶标物质对筛选的影响，使筛选针对目的靶标进行的一种方法。 这种方法首先是由Shao研究小组

9、提出，他们以未分化的PC12细胞作为消减细胞，筛选获得识别分化PC12细胞的核酸适体。削减筛选法由于能够很好区分两种不同复杂体系之间的分子差异。 J. Biotechnol., 2003, 102: 15-22,（4）光交联筛选（photo SELEX）是一种利用5碘尿嘧啶和5溴2脱氧尿嘧啶等光敏感核苷酸构建的核酸文库，在与靶标孵育后，通过紫外照射使光敏感核苷酸与蛋白质发生共价交联。光交联筛选获得的核酸适体具有更高的选择性,但是这种方法的假阳性也较高，因此需要对交联的条件进行优化以保证筛选的有效性。 J Biotechnol., 2000, 81: 167-178,硝酸纤维素膜过滤法 凝胶电泳

10、分离法 高速离心法 毛细管电泳 ,针对靶标不固定的筛选方法,优点：核酸序列能自由地与靶标分子结合； 不会引入别的物质的干扰,1.2.3 基于不同分离方法的SELEX技术,在SELEX技术中最关键、最难的是与靶标结合的和未结合的寡核苷酸序列的分离。,筛选靶标：T4 DNA polymerase, HIV-1 Rev, human -thrombin, human IgE, VEGF等40多种,利用一定孔径的硝酸纤维素膜选择性截留核酸靶标复合物而使游离的核酸序列通过。,硝酸纤维素膜过滤法 (Nitrocellulose filter),利用核酸靶标复合物与游离核酸的迁移速率不同实现两者的分离,筛选

11、靶标：IgE, Neuropeptide Y, Muts protein等,毛细管电泳筛选法 (CE-SELEX),Anal. Chem. 2005, 77, 6107-6112,可有效缩短筛选周期，但是毛细管电泳SELEX的靶分子存在一定的局限性。当靶分子为小分子时，由于结合靶分子的核酸序列与游离序列的迁移率接近，很难利用毛细管电泳将两者分离。,筛选的靶标：HIV-1 Rev, integration host factor等,利用由尺寸和电荷的不同导致核酸-靶标复合物与未结合核酸在聚丙烯酰胺凝胶中迁移速率的不同实现两者分离,凝胶电泳分离法 (Gel electrophoresis),Che

12、m. Biol., 1995, 2: 741-750,针对靶标固定的筛选方法,利用非共价键或共价健将靶分子固定在亲和性（或官能化）基质表面,基于亲和基质的传统筛选方法：亲和层析、磁分离和微珠的离心分离等,96孔板,亲和柱,官能化微珠, ,常用基质：,缺点：筛选前需要靶分子固定的步骤； 基质的存在可能妨碍核酸在靶分子固定一方的吸附； 基质和交联试剂的存在可能导致非特异性的富集； 一般需要增加反筛的实验步骤去除基质或交联试剂的影响,优点：分离方法简单，具有较好的分离效率； 能获得高亲和性很好的核酸适体,筛选靶标：Zn2, Ni2, 有机染料小分子, cellobiose和lysozyme等,针对固

13、定靶标的筛选方法优缺点,优点：靶蛋白保持着与活体内蛋白一致的天然构象； 靶蛋白不需要纯化； 不需要对靶分子事先了解； 可以同时对多种靶蛋白进行筛选； 有利于新显型的发现,针对复杂体系的筛选方法,该方法以病毒、细菌、细胞或组织切片为筛选靶标,缺点：存在大量能引起干扰的物质，需要增加反筛提高筛选效率,1.2.4 筛选新方法：,PNAS, 1998, 95: 2902-2907; 2003, 100: 15416-15421,微流体筛选 (microfluidic SELEX),原理：采用磁激活细胞分选实现核酸-靶标-磁珠复合物与游离 核酸的分离,PNAS, 2009, 106 : 29892994

14、,流式细胞仪筛选法（FACSSELEX）,Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 5190 5193,原理：采用荧光激活细胞分选实现核酸-细胞复合物与游离核 酸的分离,自动筛选法 (automated selection),优点：能进行高通量筛选，在缓冲液和筛选条件的选择上具有 灵活多样性,Biotechnol. Prog., 1998, 14, 845-850; Nucleic Acids. Res., 2005, 33: 45-54,1.3 核酸适配体的表征,在筛选之后通过测序可以获得最终文库中DNA序列的初步信息，需要实验进一步研究筛选分析得到的每个核酸适体与靶

15、标分子的相互作用，一般包括以下几个步骤。,（1）核酸适体的分类和结合能力,（2）确定核酸适体与靶标分子相互作用的最少碱基数和二级结构,在通过SELEX技术得到能结合的核酸文库，通过测序获得单个寡聚核苷酸的序列后，利用一些软件分析寡聚核苷酸序列的特征，根据单个核酸序列所包含的同源序列对筛选得到的核酸适体进行分类，然后分析每类中有代表性的核酸适体序列与靶标分子作用的能力，将对靶标分子具有高亲和性的核酸序列进行进一步的研究。,利用核酸结构预测软件分析全长序列和保守序列的二级结构和分析，这种结构预测通过单链或双链位点选择剪切的试剂（化学试剂或核酸酶）来验证或者在结构预测的基础上直接合成预测的最小核酸适体序列并考察它们与靶标分子结合情况。,（3）确定核酸适体的作用区域和关键碱基 我们通过各种不同的方法分析核酸适体各个碱基的功能。 通过常用的碱水解和各种核酶水解核酸适体获得不同的指纹图谱，可以揭示核酸适体中与靶标分子直接作用的位点； 可以通过先合成保守序列区域中碱基突变