色谱分析仪器的使用-气相色谱及气质联用

1、Jiangsu University,色谱分析仪器的使用 气相色谱（GC）与气质联用(GC-MS),江苏大学食品与生物工程学院 孙宗保 2010.11,Jiangsu University,GC与GC-MS的基本原理 GC与GC-MS应用 仪器使用与维护,色谱法简介,GC与GC-MS的基本原理,Jiangsu University,色谱流出的谱图信息,GC与GC-MS的基本原理,Jiangsu University,一 气相色谱仪及工作原理 气相色谱主要构成,GC与GC-MS的基本原理,Jiangsu University,气相色谱工作过程,GC与GC-MS的基本原理,色谱柱,流量 控制器,稳

2、压器,空气,氢气,载气,分子筛,脱水管,固定,进样口,检测器,电子部件,PC,限流器,典型的气相色谱,Jiangsu University,实验室气相色谱仪照片,Jiangsu University,气相色谱仪主要部件,1. 载气系统 包括气源、净化干燥管和载气流速控制；,常用的载气有：氢气、氮气、氦气； 净化干燥管：去除载气中的水、有机物等 杂质（依次通过分子筛、活性炭等）； 载气流速控制：压力表、流量计、针形稳压阀，控制载 气流速恒定。,GC与GC-MS的基本原理,Jiangsu University,2. 进样系统,气相色谱仪主要部件,Jiangsu University,GC与GC-M

3、S的基本原理,Jiangsu University,分流进样,样品汽化,Jiangsu University,分流进样需注意的问题,尽量减少分流歧视：分流比越大，越有可能造成 分流歧视 保证样品快速汽化（适当添加经硅烷化处理的玻 璃毛） 分流进样时，柱的初始温度尽可能高一些 柱安装时注意柱与衬管同轴,Jiangsu University,Jiangsu University,不分流进样需注意的问题,柱初始温度尽可能低一些，最好低于溶剂的沸点10-20度。溶 剂要与柱子固定相匹配。 衬管尺寸尽量小（0.25-1ml),使样品在衬管内尽量少稀释。最 好使用直通式衬管,对于比较脏的样品,要加经硅烷化

4、处理的玻 璃毛并注意经常更换 根据样品(溶剂沸点,待测组分沸点,浓度等)优化开启分流阀的 时间,一般在30-80秒之间,多用0.75分钟，可以保证95%以上的 样品进入柱子.,Jiangsu University,手动进样应注意的问题,注射速度快 取样准确，重现 避免样品间互相干扰 选用合适的注射器，用10ul进样器进样量不要小于1ul。 减少注射针尖歧视：每次进样速度尽量一致，玻璃毛放在 衬管中间偏下位置，即针尖到达的位置。 取样后可用滤纸拭去针尖外面的残留样品，但要注意不要 吸去针内样品,3. 色谱柱,毛细管柱,分离效能高、分析速度快、样品用量少,制备简单、定量准确、特殊用途,填充柱,Ji

5、angsu University,毛细管柱分类,壁涂开管柱(WCOT) 内表面涂有很薄的固定相. 载体涂渍开管柱(SCOT) 内表面先涂固态载体， 然后再涂上固定相. 多孔层开管柱(PLOT)内表面涂有多孔的固体层或吸附剂. （主要用于永久气体和低分子量有机化合物的分离）,Jiangsu University,常用毛细管柱固定液,Jiangsu University,先试手边的柱子 向老师或同学咨询 查询已发表的相似应用 如果难以确定，先用一个非极性柱，如 HP1或 HP5,柱选择,柱温操作,色谱柱老化 色谱柱流失 色谱柱温度极限 色谱柱容量,Jiangsu University,色谱仪的眼睛

6、 通常由检测元件、放大器、显示记录三部分组成； 被色谱柱分离后的组分依次进入检测器，按其浓度或质量随时间的变化，转化成相应电信号，经放大后记录和显示，给出色谱图； 检测器：广普型对所有物质均有响应； 专属型对特定物质有高灵敏响应。,4. 检测系统,Jiangsu University,检测器类型,Jiangsu University,（FID：hydrogen flameionization detector） （1）典型的质量型检测器; （2）对有机化合物具有很高的灵敏度; （3）无机气体、水、四氯化碳等含氢少或不含氢的物质灵 敏度低或不响应; （4）氢焰检测器具有结构简单、稳定性好、灵敏度

7、高、响 应迅速等特点; （5）比热导检测器的灵敏度高出近3个数量级，检测下限可 达10-12gg-1。,氢焰检测器特点,Jiangsu University,氢焰检测器的结构,（1）在发射极和收集极之间加有一定的直流电压（100300V）构成一个外加电场。 （2）氢焰检测器需要用到三种气体： N2 ：载气携带试样组分； H2 ：为燃气； 空气：助燃气。 （3）使用时需要调整三者的比例关系，检测器灵敏度达到最佳。,Jiangsu University,氢焰检测器的原理,(1)当含有有机物 CnHm的载气由喷嘴喷出进入火焰时，在C层发生裂解反应产生自由基 ： CnHm CH (2)产生的自由基在D

8、层火焰中与外面扩散进来的激发态原子氧或分子氧发生如下反应： CH + O CHO+ + e (3)生成的正离子CHO+ 与火焰中大量水分子碰撞而发生分子离子反应： CHO+ + H2O H3O+ + CO,A区：预热区 B层：点燃火焰 C层：热裂解区： 温度最高 D层：反应区,(4)化学电离产生的正离子和电子在外加恒定直流电场的作用下分别向两极定向运动而产生微电流（约10-610-14A）； (5) 在一定范围内，微电流的大小与进入离子室的被测组分质量成正比，所以氢焰检测器是质量型检测器； (6) 组分在氢焰中的电离效率很低，大约五十万分之一的碳原子被电离； (7)离子电流信号输出到记录仪，

9、得到峰面积与组分质量成正比 的色谱流出曲线。,氢焰检测器的原理,Jiangsu University,氮磷检测器（NPD）,NPD的原理 NPD是在FID的喷嘴和收集极之间放置一个含有硅酸铷的玻璃珠。这样含氮磷化合物受热分解在铷珠的作用下会产生多量电子， 使信号值比没有铷珠时大大增加，因而提高了检测器的灵敏度。这种检测器多用于微量氮磷化合物的分析中。,只对氮、磷有很高的选择性 氮的灵敏度：0.1pg/sec；磷为：0.05pg/sec 主要应用于：药物、燃料、香料、农药残留,pptrillion,ppb,ppm,ppthousand,percent,1 ppm =,1 ng,1 L,m,1 m

10、g,Liter,1 L,m,Liter,=,=,TCD,FID,ECD,AED,PID,NPD (N),NPD (P),MSD,(SIM),(SCAN),FPD (S),IRD,ELCD,ELCD,(S or N),(X),10-15,fg,10-12,pg,10-9,ng,10-6,10-3,mg,GC检测器比较,Jiangsu University,二 气质联用仪及工作原理,GC与GC-MS的基本原理,2、仪器组成 按质量分析器(或者磁场种类)可分为静态仪器和动态仪器，即稳定磁场（单聚焦及双聚焦质谱仪）和变化磁场（飞行时间和四极杆质谱仪）。 MS仪器一般由进样系统、电离源、质量分析器、真空

11、系统和检测系统构成。,Jiangsu University,GC,MS,Jiangsu University,GC与GC-MS的基本原理,(1) 进样系统,(2）真空系统,质谱仪中所有部分均要处于高度真空的条件下(10-4-10-6托或mmHg柱), 其作用是减少离子碰撞损失。真空度过低，将会引起： a）大量氧会烧坏离子源灯丝； b）引起其它分子离子反应，使质谱图复杂化； c）干扰离子源正常调节； d）用作加速离子的几千伏高压会引起放电。,加热区,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,

12、.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,出口 (到机械泵),转子,吸油阱,进油口,油液面,排油口,定子,泵腔,油液面观察窗,10-1 - 10-2 torr,10-5 - 10-6 torr,到前级泵,轴转速可达 60,000 每分钟,旋转叶片,固定叶片,分子涡轮泵,离子源,透镜组,Quad,-e,-e,-e,-e,-e,-e,-e,-e,-e,-e,-e,(3)电离源（EI）,作用过程： 采用高速(高能)电子束冲击样品，从而产生电子和

13、分子离子M+，M+继续受到电子轰击而引起化学键的断裂或分子重排，瞬间产生多种离子。 特 点： 使用最广泛，谱库最完整；电离效率高；结构简单，操作方便；但分子离子峰强度较弱或不出现（因电离能量最高）。,电子的产生（灯丝）,样品分子与电子流混合 ,Inlet - Ionizer Mass Filter - Detector Data System,-e,离子源,-e,-e,-e,-e,-e,-e,-e,-e,-e,-e,样品被电离的地方（电离盒）,+,+,+,+,+,透镜组,Quad,Jiangsu University,GC与GC-MS的基本原理,Jiangsu University,(4) 质

14、量分析器 作用是将不同碎片按质荷比m/z分开。 质量分析器类型：磁分析器、飞行时间、四极杆、离子阱等。,四极杆质量分析器采用的是过滤式分离的方式逐一将离子分离，因此该质量分析器又被称为四极杆质谱过滤器。对于不同质量数的离子，在整个分析器的电场中存在着其自身对应的稳定厂区，当质量分析器所设的电压通过某个离子的稳定厂区时，该离子便会通过质量分析器而进入检测设备中。,GC与GC-MS的基本原理,四极杆质量分析器,离子源,四极滤质器,检测器,进样,分子泵,Jiangsu University,离子阱实际上通过电场和磁场将气相离子控制并储存的装置，由一个环形电极和上下的端盖电极构成，以端盖电极接地，在环

15、形电极上加以变化的射频电压，以保证处于阱中的合适的离子在稳定的轨道上旋转, 当离子源产生的离子进入阱中后，射频电压开始扫描，储存在阱中的离子便会依次被提取到检测器中。,内置式离子源的离子阱,外置式离子源的离子阱,GC与GC-MS的基本原理,Jiangsu University,(5)检测器 质谱仪常用的检测器有直接电检测器、电子倍增管、闪烁检测器和微通道板等。 电子倍增管运用质量分析器出来的离子轰击电子倍增管的阴极表面（打纳极）,使其发射出二次电子，再用二次电子依次轰击一系列电极，使二次电子获得不断倍增，最后由阳极接受电子流，使离子束得到放大而被检测出。,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+

16、,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,四级杆,检测器离子聚焦,高能打拿极,电子倍增器,电子,正离子,信号输出,GC与GC-MS的基本原理,质谱常用术语,丰度 质荷比(m/z) 基峰 分子离子 碎片离子 母离子 子离子 偶电子离子 奇电子离子,质谱基础,GC与GC-MS的基本原理,偶电子离子,常见元素同位素表,M/Z,Abundance,82,166,182,303,50,100,150,200,2

17、50,1000000,Scan 33 (5.289 min): ALKDEMO.D,M/Z,Abundance,82,166,182,303,50,100,150,200,250,1000000,Scan 34 (5.297 min): ALKDEMO.D,总离子色谱,气质联用数据是三维的,Jiangsu University,GC与GC-MS的基本原理,Jiangsu University,Jiangsu University,Jiangsu University,GC与GC-MS应用,分析方法的建立 GC与GC-MS应用,GC与GC-MS应用,Jiangsu University,一 分析

18、方法的建立,样品的来源和预处理方法 确定仪器配置 确定初始操作条件 分离条件优化 定性鉴定 定量分析,GC与GC-MS应用,Jiangsu University,样品的来源和预处理方法 GC能直接分析的样品通常是气体或液体，固体样品在分析前应当溶解在适当的溶剂中，而且还要保证样品中不含GC不能分析的组分（如无机盐），可能会损坏色谱柱的组分。 我们在接到一个未知样品时，就必须了解的来源，从而估计样品可能含有的组分，以及样品的沸点范围。 如果样品体系简单，试样组分可汽化则可直接分析。如果样品中有不能用GC直接分析的组分，或样品浓度太低，就必须进行必要的预处理，如采用吸附、解析、萃取、浓缩、稀释、提

19、纯、衍生化等方法处理样品。,GC与GC-MS应用,Jiangsu University,预处理方法 溶剂萃取(LLE) 同时蒸馏萃取（SDE ） 固相微萃取（SPME ） 顶空(HS) 搅拌棒吸附(SBSE) 吹扫捕集(P T purge trap ) 热解吸（热脱附）(TDE) 衍生化 。,GC与GC-MS应用,Jiangsu University,衍生化的作用： 改善了待测物气相色谱性质（改善了样品挥发性、样 品峰形、样品分离） 改善了待测物的热稳定性（特别是包含极性官能团的 化合物） 改变了待测物的分子质量 改善了待测物的质谱行为 引入卤素原子或吸电子基团 通过一些特殊的衍生化方法，可以

20、拆分一些难分离的 手性化合物,衍生化,GC与GC-MS应用,Jiangsu University,衍生化方法不当引起的弊端： 柱上衍生化有时会损失色谱柱 某些衍生化试剂需在氮气流中吹干除去，方法不当会 有损失 衍生化反应不完全，会影响灵敏度 衍生化试剂选用不当，会使待测物分子量增加过 多， 接近或超过一些小型质谱检测器的质量范围,GC与GC-MS应用,Jiangsu University,常用的衍生化方法：,硅烷化 硅烷基衍生物广泛用于气相，是用三甲基硅烷取代酸、醇、硫 、醇、 胺、酰按、烯醇酮醛等，分子中活泼H而形成。三氟官能团常用于提高 电子捕获检测的灵敏度。衍生方法使氨基酸的定量和定性分

21、析容易。 烷基化 是活泼H被脂肪族戓芳基（如苄基）所取代。这可用硅烷化衍生试剂对 含酸性氢的化合物进行改性，如羧酸和酚。将其能转化为酯。烷基化 也可用来制备醚类、硫醚、硫酯、N-烷基胺、酰胺和磺胺。 酰化 可通过羧酸或羧酸衍生物反应将包含活泼H的化合物转化为酯、硫酯和 酰胺。全氘代衍生物有助于解析硅烷化组分的质谱图。 增强检测性能的试剂 当紫处吸收光谱254nm检测灵敏度为0或很低时通过在被 测分子中接入在254nm有高吸光性的发色团可增强检测性能所有这些试 剂均使还原性电化学检测或荧光检测容易,GC与GC-MS应用,Jiangsu University,确定仪器配置和初始操作条件,GC与GC

22、-MS应用,Jiangsu University,进样口、色谱柱、检测器的温度设定,.柱温的确定,首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度（超过该温度固定液易流失）和最低使用温度（低于此温度固定液以固体形式存在）范围之内。,柱温升高，分离度下降，色谱峰变窄变高。柱温，被测组分的挥发度，即被测组分在气相中的浓度，K，tR，低沸点组份峰易产生重叠。,柱温，分离度，分析时间。对于难分离物质对，降低柱温虽然可在一定程度内使分离得到改善，但是不可能使之完全分离，这是由于两组分的相对保留值增大的同时，两组分的峰宽也在增加，当后者的增加速度大于前者时，两峰的交叠更为严重。,柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸

23、点时的温度。 组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温。,Jiangsu University,定性分析,1.利用纯物质定性的方法 利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。,2.利用文献保留值定性 相对保留值r21（指组分2和组分1的调整保留值之比）仅与柱温和固定液 性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以 用来进行定性鉴定。,GC与GC-MS应用,Jiangsu University,3.保留指数

24、 又称Kovats指数()，是一种重现性较好的定性参数。测定方法： 将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。 其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z1个碳原子。被测物质 X 的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：,GC与GC-MS应用,Jiangsu University,4 谱库检索,PBM检索 NIST谱库检索,GC与GC-MS应用,Jiangsu University,什么是标准谱图： （1）EI源全谱，电子能量70eV （2）纯样品或GC/MS分离成单一的峰 （3）样品浓度适量

25、，质谱图丰度成比例 与标准谱图相比较的五个基本因素： （1）辨别有无分子离子峰 （2）对比基峰 （3）对比强度较大的裂分碎片，对比特征官能团 （4）对比同位素峰 （5）对比保留时间。,谱库检索,库检索所作谱图与标准谱图相匹配，可否定性，应辨别分析：,（1）该化合物在GC/MS分离中挥发点是否正确（查化学手册）对比后方可确认 （2）GC/MS分离时低挥发点的化合物与高挥发点化合物是同一库检索图，肯定不是同一化合物。可能是高温时一热解产物与低挥发点化合物有相同的谱图，这在高碳脂肪烃分析中经常发生 （3）保留时间相近的几个谱图是同一库检索图，很可能是异构体，可用保留时间区别，或用双柱定性鉴别 库检索

26、中基峰的变化与辨别： （1）一个质谱图只有一个基峰，如有多个基峰出现或进样超量，比例失调，或有杂峰叠加 （2）局部放大质谱图，要与原图同时提供，以示区别,库检索中的样品质谱图与标准图中的一部分谱图相匹配，对质谱解析有重要参考价值,系列离子相同，可确认是那类化合物，如常见离子系列表，可将系列离子分类：,Jiangsu University,定量分析,面积归一化法 外标法 内标法,Jiangsu University,面积百分率法（面积归一） 各组分浓度以面积百分率表示，该结果可以确认大概的浓度，但有误差。,特点及要求： 简单，但是定量准确性和重复性差。 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。,Ji

27、angsu University,外标法 该法是应用最广泛的方法之一，其误差来源主要是进样误差，因此，分析前一定要做面积重复性（即进样重复性）实验。 特点及要求： 外标法不使用校正因子，准确性较高。 操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，必须保证进样量准确 ，适用于大批量试样的快速分析。 要求仪器必须具有良好的稳定性，而且应定期进行重新校正。,Jiangsu University,内标法 在样品中添加内标物，通过组分与内标峰的面积比，对组分进行定量。该方法减小了进样误差对定量结果的影响。 特点及要求： 内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不

28、大。 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。 内标物选择困难。,Jiangsu University,内标物的选择,选择内标物的标准 样品中不存在 化学性质与样品相似 与样品有相同的浓度范围 不会与样品发生反应 在感兴趣组分附近流出 可得到分离良好的、干净利落的峰 色谱性质稳定 可迅速容易得到,Jiangsu University,二 GC与GC-MS应用,Jiangsu University,Jiangsu University,Jiangsu University,仪器条件 色谱条件： DB-1701色谱柱(30m0.25mm0.25um)，载气He，流量1mL/min，不分流，进样口温度250，柱温：起始温度32，以3/ min升温至120，再以10/ min升温至250，保持10min。 质谱条件：接口温度250，离子源温度230，电离方式EI+，电子能量70eV，扫描质量范围33-450u。,Jiangsu University,Jiangsu University,Agilent 6890-5973 ThermoFisher Trace Ultra-ITQ1100,仪器使用与维护,Agilent 6890-5973,Jiangsu University,编辑质谱方法（安捷伦68905973）,Jiangsu University,Agi