园艺植物生物技术第三章

1、Horticultural Plant Virus-Free and Rapid propagation in vitro 园艺植物脱毒与离体快速繁殖,Contents,1. Horticultural Plant Virus-Free 脱毒的意义 脱毒的方法 脱毒植物的鉴定 2. Rapid propagation in vitro 离体快繁 意义 方法 3. Artificial seed 人工种子,1.1 Damage of virus 全世界已发现植物病毒有近788种。 1.组织和细胞病变； 2.新陈代谢等生理机能受到干扰； 3.外观表现不正常状态； 4.病毒经无性繁殖逐代积累，导致种

2、性退化，造成产量下降或品质降低甚至全株死亡，给农业生产造成巨大损失。,Part 1 Horticultural Plant Virus-Free,1. Significance of Plant Virus-Free,1.2. Concept ： 采用一定的方法除去植物体内病毒的技术。,Virus-freeseedling 无病毒苗：指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性反应的苗木。,1.3 Significance of Plant Virus-Free,任何一种优良品种均需有一个稳定地保存其遗传性状的繁殖方法。 离体无性繁殖可以很好地保持品种的优良特性，是无

3、性繁殖品种繁育的理想途径。,1.3.1.能够有效地保持优良品种的特性,1.3.2. 快速繁殖品种，使优良品种迅速应用 离体繁殖周期短 不受季节限制 繁殖系数高 繁殖速度是任何其他方法所不能比的， 又称之为 快繁,1.3.3. 生产无病毒种苗，防止品种退化,受病毒危害严重的作物： 大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草 蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、箩卜 果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉 花卉：香石竹、各种菊花、天竺葵、紫罗兰,1.3.4. 节约耕地，提高农产品的商品率,块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年产品用留作种的比例： 大蒜：留种量占产量的五到八分之一 马铃薯：留种量占产量的十分之一 贝母：留种

4、量占产量的三分之一,1.3.5. 便于运输,常规的块根、块茎等，体细胞大、含水量高，包装、运输十分不便。 离体繁殖的种苗体积小，易携带，运输十分方便。,以马铃薯为例： 按一亩地4000株计算，常规薯4000个重200kg（每个50g），若用试管薯4000个则只有2kg（每个0.5g）。,脱毒与未脱毒马铃薯对比,2. Principal and methods,2.1 Principal,a.植物病毒本身不具有主动转移的能力 在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞间连丝，速度很慢，难赶上活跃生长的茎尖；,b.在旺盛分裂的分生细胞中，代

5、谢活性高，竞争抑制了病毒的复制； c.在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。 d.在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖 。,热处理脱毒原理 病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。 热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。 作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。,2.2.1 Heat treatment 热处理脱毒法,热处理方法 （1）愈伤组织热处理 离体培养 愈伤组织 热处理继代 分化培养。 常用温度及时间：低温3738处理2周、4周或8周；

6、高温50处理35min。,（2）热空气处理脱毒法 试验母株在高温生长室中生长一段时间，其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培养。 生长室温度35-40 光照300010000 lx,Advantages : 方法简单，效果明显。 disadvantages : 1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。 2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热枯死，造成损失 3）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。,Advanta

7、ges and disadvantages,其它效果 香石竹（康乃馨）在3840下经两个月处理可除去全部病毒。,马铃薯在37下处理1020天能除去卷叶病毒。,2.2.2 Virus-free bytissue culture 组织培养脱毒法 包括茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、珠心组织培养脱毒。 （1）meristem culture 茎尖培养脱毒法 脱毒效果好 后代遗传稳定 使用最广泛的一种方法,1）原理及依据 病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少 病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争 2）操作程序 外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，放入培养室

8、内进行培养，并及时观察和记录培养结果。,茎尖培养,茎尖大小：一般以带1-2片叶原基为好，大小为0.2-0.3毫米为宜，超过0.5毫米时，脱毒效果差。（外植体过小茎尖存活率低） 培养基：能使茎尖快速生长、分化的培养基均适于脱毒。 前处理：切取茎尖之前，植物材料如经过预处理，如热水或热空气处理、低温处理、药物处理，均可大大提高脱毒效率。 培养条件：同一般茎尖培养 外植体生理状态：由活跃生长的芽上切取,优缺点：,茎尖越小，去病毒机会越大，脱毒效果就越好，但同时因为其含营养及水量太低，故培养时对培养基的要求就越高，对剥离技术要求也越高。,（2）Callus culture 愈伤组织培养脱毒法 1）原理

9、及依据 病毒在植物体内分布不均匀 病毒复制的能力衰退或丢失 继代培养的愈伤组织产生抗性变异,2）技术关键 诱导再生植株的愈伤组织 3）操作程序 植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织，愈伤组织多次继代，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株。 愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定，常出现一些变异。,（3）Nucellar tissue culture 珠心组织培养脱毒法 病毒是通过维管组织传播，而珠心组织和维管束系统无直接联系，故可以通过珠心组织离体培养获得无病毒植株。 目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。,缺点： 会有20%30%左右的变异率，同时无毒苗苗期较长。柑橘

10、要68年才能结果。,2.2.3. micro-grafting in vitro 应用微体嫁接的原因： 木本植物茎尖培养难以生根形成植株。 具体做法： 将极小的茎尖（0.14mm1.0mm）作为接穗嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。 优点：接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。 微嫁接要求的剥离技术高，嫁接成活率与接穗大小呈正相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关。,微体嫁接法(micro-grafting),脱除病毒的关键： 要求剥离技术很高 需要考虑砧木和接穗对营养组成的不同要求； 与接穗的取材季节有密切关系（苹果

11、46月取材嫁接成活率较高。）,3.1. Morphology identification形态检测法 看植株的茎叶是否有该病毒所有可见症状。,番茄无菌小苗,厚叶莲花掌,3、 Virus-free seedlingidentification,植物病毒的症状,植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物上由病毒引起外部症状主要有以下几种： 变色：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病毒有；香石竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒等。 坏死：常见的坏死是病斑或斑点。有轮斑、环斑、条斑等。如香石竹坏死斑点病毒、，凤仙花坏死斑点病毒草等。 畸形：植株可出现矮缩、矮化或叶片皱缩、卷叶、蕨叶等病状。 萎蔫

12、：主要是指植物根或茎的维管束组织受到破坏而发生供水不足所出现的凋萎现象。,3.2. indicating Plant 指示植物法,指示植物,接穗,嫁接后的植物,定义:将一些对病毒敏感、症状特征显著的植物作为指示植物(又叫鉴别寄主),利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法.,Advantages : 方法简单、灵敏、准确、方便 Disadvantages : 枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度,而只能测出相对的感染力,Advantages and disadvantages,3.3.Electron microscope identification电子显微镜鉴定法,小于0.1mm的

13、病毒颗粒 用电子显微镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否有的病毒粒子存在，还可测量病毒颗粒的大小、形状和结构。 较为先进的方法，但需一定的设备和技术,利用抗原与抗体特异反应的特性，用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒的种类，常用的有沉淀反应法、琼脂扩散法、酶联免疫吸附法。其中酶联免役吸附反应（ELISA）是常用的一种方法。,抗血清的基本原理是通过植物病毒的抗原与抗体的专化结合, 形成可见反应而加以判断。由于植物病毒抗血清具有高度的专化性, 受体植物无论显、隐症, 无论是何种传播介质, 均可通过抗血清反应法准确判断病毒的存在与否, 进行病毒的快速诊断。,3.4.Antiserum identific

14、ation 抗血清鉴定法,3.5. Molecular techniques identification分子生物学鉴定（1）核酸杂交技术 （2）PCR法（3）dsRNA分析 （4）电镜检测法,4、 The preservation andpropagation ofvirus- freeseedling,4.1 The preservation ofvirus-freeseedling (1). 隔离保存 专用的隔虫纱网棚室 离体培养,2. 低温保存 将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上，低温下离体保存，是长期保存无病毒苗及其他优良种质的方法。只需半年或一年更换培养基，也叫最小生长法

15、。 3.冷冻保存（超低温保存） 用液氮（-196）保存植物材料的方法。常用冷冻保护剂为DMSO（5-8%）、甘油、脯氨酸（10%）、各种可溶性糖、聚乙二醇等。,4.2 The propagation ofvirus- freeseedling 1、继代培养快速繁殖：愈伤、不定芽、丛生芽 2、快繁苗的生根及微型鳞芽的培养,Part 2 Rapid propagation in vitro,1. Introduction,1.1 Concept 指通过无菌操作，将外植体接种于培养基上，在人工控制的营养和环境下进行培养，使其在较短时间内快速地再生出遗传性一致的大量完整植株的方法，是工厂化育苗的技术基

16、础。,1.2 Advantages of rapid propagation in vitro 1).繁殖效率高，生长速度快； 2). 培养条件可控制性强，可周年生产（一般6个增殖周期/年）； 3).占用空间小； 4).管理方便，利于自动化控制； 5). 便于种质交换和保存。,1.繁殖稀缺或急需的良种植物； 2.无病毒苗木的快速繁殖，如草莓、马铃薯、香蕉等； 3.自然界无法用种子生产繁殖或难以保持后代的三倍体、单倍体及基因工程植株的快速繁殖； 4.拯救濒危植物； 5.种质的保存和交换。,1.3 Application,2. Methods,2.1 The establishment of th

17、e sterile culture system 1).母株和外植体的选取：母株性状稳定、健壮、无病虫害。木本与较大草本-茎段、顶芽、腋芽；草本-叶片、叶柄、花茎、花瓣 2).无菌培养物的获得：15d 3). 外植体的启动生长：腋芽-细胞分裂素0.51.0mg/L，生长素0.010.1mg/L；不定芽-较高水平细胞分裂素；愈伤-生长素多。需要4-6周。,2.2 Shoot proliferation approach 茎芽增殖的途径,侧芽增殖途径（lateral bud proliferation） 不定芽增殖途径（adventitous bud proliferation ） 体细胞胚增殖途

18、径（somatic embryo proliferation ） 原球茎增殖途径（protocorm-like body proliferation ）,4-8周继代一次。一个芽苗增殖数量一般为5-25个或更多，多次继代可大量繁殖。增殖培养基适当提高细胞分裂素和矿物质浓度,1) lateral bud proliferation,指利用外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境（含有外源细胞分裂素）中不断发生腋芽而呈丛生状芽，将单个芽转入生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。 不经过愈伤阶段，后代变异小，应用普遍，也可用于无病毒苗的生产。,已在草莓、香石竹、唐菖蒲、非洲菊、苹果等应用。,2) adv

19、entitous bud proliferation,指外植体在适宜培养基和培养条件下，形成不定芽，后经生根培养，获得完整植株的繁殖方法。 两种方式：通过愈伤组织产生不定芽（君子兰、猕猴桃）和直接产生不定芽（非洲紫罗兰）。 外植体涉及多种器官，如茎段、叶、根、花器官等。繁殖系数高，但变异率较高，尤其是通过愈伤途径产生的植株。,A,B,E,C,花烛（红掌）叶片离体培养及植株再生,3) somatic embryo proliferation,指外植体在适宜培养环境中，经诱导产生体细胞产生体细胞胚，从而形成小植株的繁殖方法。分为间接途径（经愈伤途径）和直接途径两种。 成苗数量大、速度快、结构完整。

20、但由于对其发生及发育过程了解不够，应用上还没有前两种广泛。,菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察,4) protocorm-like body proliferation,是兰科植物特有的一种快繁方式。指茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎的繁殖类型。原球茎可以增殖形成原球茎丛。,大花蕙兰原球茎增殖与植株再生,2.3 Seedling rooting,1).离体生根：也称试管内生根。降低无机盐浓度，减少或去除细胞分裂素，增加生长素浓度。 2).活体生根：也称试管外生根。通常芽苗可先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培养5-10天，然后移到基质中生根。 生根培养时间一

21、般为2-4周。,2.4 Plant transplantation & acclimation,1.移栽：洗去根部的培养基，将小植株移栽入培养基质中。 2.驯化管理：移栽初期要保证空气湿度，减少叶面蒸腾；弱光照。同时，逐渐降低空气湿度，使其适应自然环境条件；增加光照强度。另外注意防止病害的发生。,3、Commercial application,植物快繁的重要用途是进行植物的商业化生产。世界上快繁商业化开始于上个世纪美国的兰花工业。我国的香蕉快繁苗占全国组培苗的2/3。其次有甘蔗、兰花、马铃薯、甘薯等。,植物种苗工厂化生产,Part 3 Artificial seeds,1. Concept & significance,1.1 Concept 1). In a narrow sense：指植物离体培养中产生的胚状体，包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。 2. Broad sense：在胚状体或一块组织、一个器官之外加上必要的营养成分后，用具有一定透性而无毒的材料将其包裹起来，形成与天然种子相似的颗粒体。,（