神经细胞培养讲义课件

1、神经细胞培养,1,PPT学习交流,第一节：细胞培养的基本知识,1定义： 组织培养 (Tissue culture ) ： 细胞培养 (cell culture)： 器官培养 ( organ culture)： 统称为体外培养 （In vitro),2,PPT学习交流,2 组织或细胞培养的优点：,1）：研究对象是活细胞 2）：研究条件可以人为的控制 3）：研究的样本可以达到比较均一性 4）：研究的内容便于观察、检测和记录 5）：研究的范围比较广泛 6）：研究的费用相对比较经济 7） ：可作为一些遗传物质的运载细胞 8) ：干细胞的广泛应用前景,3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差异 ；

2、2）细胞培养存在一定的不稳定性,3,PPT学习交流,4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性,4,PPT学习交流,5,PPT学习交流,6,PPT学习交流,5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子； b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类为3537；鸟类为38.5 b 气相及PH 值 ：O2及CO2的值： CO2=5%；PH=7.27.4 c 渗透压：260320m mol/L,7,PPT学

3、习交流,3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！ 无毒：与细胞直接接触者培养器皿、底物、培养基，蒸馏水等； 间接接触者配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染,8,PPT学习交流,6 常用的培养用液及培养基,培养用液：水 平衡盐溶液（）（见表） 消化液胰蛋白酶液（%） 二乙烯四乙酸二钠（） 胶原酶 培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白） 合成培养基（ S F12 （） ）等,9,PPT学习交流,常用的平衡盐溶液（g/L）,10,PPT学习交流,第 二节：神经细胞体外培 养的 基本概念和方案,神经细胞培养的类型 1 神经细胞的原代培养

4、原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、组织或器官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。 2 细胞系培养,11,PPT学习交流,一 神经元的原代培养(Primary culture),一、组织来源： 1） 种属： 大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等 2）年龄：一般为胚胎或新生动物组织 神经胶质细胞：生后早期 蒲肯野细胞 ：胚胎末期 颗粒细胞： 生后两周以内 主要根据轴突和树突广泛分枝发育之前培养,12,PPT学习交流,二、常用试剂

5、1） 培养液 A DMEM ： B F12 培养液 C DMEM/F12 培养液 D 无血清培养液加神经营养因子 2） D-Hank液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（HBSS） 聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min 神经营养因子： 睫状神经营养因子（ ciliary neurotrophic factor, CNTF): 支持交感神经、副交感神经和感觉神经的生长与存活； 脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor ,BDNF):支持外周和中枢特殊细胞群体的神经细胞； 硷性成纤维生长因子（basic fibroblast

6、 growth factor, bFGF ) 等,13,PPT学习交流,三、培养操作过程 新生13d SD大鼠，麻醉后75%酒精浸泡消毒，断头后移入超净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中 剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37培养箱，定期振摇促消化。消化约20min， 用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次10min， 吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数， 用含10%胎牛血清的DMEM培养基

7、，稀释细胞制成1106/ml细胞悬液，接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内（板孔放置0.80.8cm的小盖玻片），放入5%CO2培养箱，37培养。,14,PPT学习交流,四、神经元的鉴定： 神经元特异性烯醇化酶（ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白（Microtubule associated protein MAP2） 神经元, 五、神经元的纯化： 胞嘧啶阿拉伯糖 ，培养两至四天后用含510 mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养24 hour ,然后改用常规培养液。,15,PPT学习交流,培养过程中注意事项,1） 培养底物的处理： 多聚赖氨酸和多

8、聚鸟氨酸 细胞外基质成分（胶原） 细胞黏附分子 单层非神经细胞 单层的胶质细胞 2） 胰蛋白酶的作用时间： 3）细胞合适的换液时间：大脑皮质 不用经常换液 海马神经元应半量换液 胶质细胞经常换液,16,PPT学习交流,六、神经元的观察： 刚分离出的神经元呈圆形，用倒置显微镜观察有明显的光晕。 接种一般在2-6小时可贴壁；8小时已有纤细有突起长出 24小时后可见细胞体积开始增大，呈圆形或椭圆形。生长良好的细胞可见胞体周围有明显的光晕，立体感强，突起以单、双突起为主 培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态多样，有些具有分枝的突起， 培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光滑的胞体，发育良好的突起。,

9、17,PPT学习交流,18,PPT学习交流,19,PPT学习交流,20,PPT学习交流,21,PPT学习交流,MAP-2,22,PPT学习交流,A,B,NSE stain neuron,TH stain neuron,23,PPT学习交流,Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus,24,PPT学习交流,Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50m),N,25,PPT学习交流,运动神经元 Dil标记,26,PPT学习交流,Purkinje c

10、ell in culture (PEP-19),27,PPT学习交流,28,PPT学习交流,29,PPT学习交流,30,PPT学习交流,31,PPT学习交流,32,PPT学习交流,33,PPT学习交流,34,PPT学习交流,35,PPT学习交流,36,PPT学习交流,37,PPT学习交流,二、胶质细胞的培养,38,PPT学习交流,胶质细胞 纤维性 的分类：a大胶质细胞 星形胶质细胞 原浆性 少突胶质细胞 b小胶质细胞 周围神经系统主要是施万细胞,39,PPT学习交流,研究胶质细胞的方法,1） 从未成熟的脑组织分离、培养获得大量胶质细胞 2）已经开发出能识别胶质细胞的免疫学标志物。,40,PPT

11、学习交流,根据免疫组化反应分类： 型星型胶质细胞和型星型胶质细胞：,41,PPT学习交流,利用细胞培养可研究胶质细胞的特性,受体的表达 神经营养因子的分泌 酶的诱导、蛋白质的合成 神经递质的摄取 髓鞘的形成 神经的局部免疫反应 代谢过程,42,PPT学习交流,胶质细胞培养的局限性,1 大多来自于未成熟大脑，所以不能达到与体内相一致的成熟程度，成年可能有干细胞的存在。其形态可能随培养条件而发生变化。 存在不同的细胞亚群 其性质有赖于他们与特殊神经元相互作用。,43,PPT学习交流,培养用液,培养基：MEM400ml + 血清 45ml+GLU-谷氨酰胺 青链霉素溶液8ml 葡萄糖-谷氨酰胺 青链

12、霉素溶液（100ml） ：葡萄糖 30g；谷氨酰胺 100mmol/l；青霉素 2.5X105U; 链霉素 2.5X10 g 胰蛋白酶：0.25%,44,PPT学习交流,培养的方法： 1）取材 生后1天的大鼠，75%酒精消毒，断头，置于培养皿中 2）沿纵轴剪开皮肤和颅腔，取出大脑皮质，去除嗅球等 3 去除脑膜，洗涤 （Hanks液） 4） 组织剪成碎块，37缓慢振荡约10 min。 5）重复过滤数次，收集细胞悬液，调整细胞密度104106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵育箱培养,45,PPT学习交流,（或者6 ）移入试管吹打或加入胰蛋白酶形成单细胞悬液 7） 加入完全培养基终止 8）接种3天

13、后换液，以后每两天换液 9）传代, 0.25% 胰蛋白酶消化（覆盖细胞层即可）或着用摇晃的方法,46,PPT学习交流,传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁大部分 表面以前，不要急于传代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使细胞尽快适应新环境 鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acid protein GFAP，A2B5） 少突胶质细胞 鉴定：GalC（-galactosidase),47,PPT学习交流,神经胶质细胞分离和纯化流程,第0-12天 大鼠脑皮质混合细胞培养,第12

14、天 预震荡（260rpm，1.5h）收获非贴壁细胞,震荡（260rpm，18h）,第13天 贴壁的扁平细胞,富含型星型胶质细胞,37培养1h,收获贴壁细胞,富含小胶质细胞,非贴壁的，有突起的细胞，（前体细胞）,富含型星型胶质细胞,含10%胎牛血清培养,富含少突交质细胞,化学限定培养,48,PPT学习交流,其他可选择的分离培养方案,1 低密度接种培养获得型胶质细胞原理： 在低密度时神经元和产生型胶质细胞和少突胶质细胞的前体细胞不能存活 优点：简单 缺点：1）仅能获得型胶质细胞 2） 成纤维细胞增殖能力更强 3）部分型胶质细胞体积变大 2 利用抗原和抗体结合原理用流式细胞仪分选获得 3 小胶质细胞

15、在营养剥夺的情况下可以生长良好,49,PPT学习交流,污染细胞的去除,1 成纤维细胞的污染：为型星型胶质细胞主要污染细胞（用抗纤维结合素（fibronection)的抗体鉴别） 1）预防为主；取材小于两天鼠，脑膜驱除干净， 2）用D-缬氨酸代替培养基中L-缬氨酸 2 小胶质细胞的污染：预震荡的方法可以驱除大部分小胶质细胞，或者在培养液加入 5mmol/l的L-亮氨酸甲酯，两小时后可杀死小胶质细胞。 3 少突神经胶质细胞的污染：1 ）含血清培养； 2）在传代培养时用抗半乳糖脑苷脂抗血清或补体处理,50,PPT学习交流,51,PPT学习交流,GFAP,52,PPT学习交流,human Schwan

16、n cells,53,PPT学习交流,细胞系的生长过程： 有限细胞系：原代培养传代期衰退期 无限细胞系：滞留期 指数增长期 平台期,三、神经细胞系培养,54,PPT学习交流, ,有限细胞系,无限细胞系,指数细胞数量,培养时间（周）,原代培养,细胞系阶段,55,PPT学习交流,神经肿瘤细胞系培养,优点： 容易生长、增殖速度快、实验操作简单等优点； 可以用液氮长期保存； 培养条件标准化； 可以导入外源基因； 缺点：不能表现出神经元分化的许多过程，不能植入人体。,56,PPT学习交流,神经细胞系的建立： 1）动物诱发性神经肿瘤分离细胞进行培养（PC12） 2）将连续细胞系的细胞与神经系统特殊区域分离

17、的细胞融合。 3）利用含有癌基因的逆转录病毒感染神经细胞，使神经细胞获得永生。,57,PPT学习交流,Neuroblastoma cells on glass slide,原始数据图，颜色表示荧光强度,58,PPT学习交流,Neuroblastoma cells on silicon wafer,硅片Ra=20nm 神经母细胞瘤细胞 生长密度很高 细胞膜电位正常 活性很高 Rh-123染色 荧光照片 100X,59,PPT学习交流,神经母细胞瘤细胞贴附良好， 开始分化并且形成网络,60,PPT学习交流,大鼠嗜铬细胞瘤株PC12的培养,PC12细胞；来源于大鼠嗜铬细胞瘤克隆 ，其具有嗜铬细胞瘤和

18、肾上腺嗜铬细胞相关的表型。可以合成儿茶酚氨，在有NGF的作用下细胞停止增殖，生长出神经突起等特点。 优点：1）相当高的稳定性和同质性 2）分化程度高，对NGF有很强的反应 3）已经具备了PC12细胞的生物学特征的背景资料 所以常被广泛用于神经细胞分化和功能的研究,61,PPT学习交流,一、 PC12细胞的常规培养 1）培养液：85%RPMI1640培养液、10%马血清、5%胎牛血清，也可用DMEM或 F12 2）培养的底物：PC12细胞对塑料和玻璃黏附能力较差，所以必须在培养前进行底物处理：胶原、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等,62,PPT学习交流,PC12细胞的培养和传代,1）PC12细胞 增倍时

19、间为2.54天 实际可7-10天传代一次。 2) 传代比例为1：3或1：4 3）换液时间为2-3天 每次换液约为2/3 的培养液 4）通过机械分离进行传代培养-用吸管轻轻吹打 5）必须选择生长在胶原或着其他底物的细胞群体进行传代,63,PPT学习交流,PC12细胞的冻存和复苏,PC12细胞可长期冻存保种 过程： 细胞吹打从培养皿脱落，离心收集，并悬浮与10%DMSO的完全培养液中，用冻存管分装细胞悬液，放入-80C 过夜 达6个月。 长期冻存可放置于液氮罐中。 复苏：37 C 水浴中快速复温，离心漂洗去除冻存液后 重悬浮于完全培养液。,64,PPT学习交流,PC12细胞培养常出现的问题,1）

20、细胞生长不良 血清问题或 密度过低 2）细胞贴壁不良 3）对 NGF 反应不良 细胞群体变异、NGF 失活,65,PPT学习交流,神经生长因子（NGF)的处理,1 神经纤维的生长研究：1） 细胞密度(2.510)x104 2)合适的底物处理方案:NGF可减弱细胞对塑料培养皿的黏附能力 3)NGF的浓度: 工作浓度为 2nmol/l储存浓度为 250g/ml， 溶剂为醋酸钠缓冲液(ph=5) 温度为-80 4)作用时间 :10天左右,神经生长速度为50 m/d,66,PPT学习交流,2 神经纤维再生: 研究NGF对神经再生的作用。 方法： NGF预处理一周 吹打 离心 ，去上清液 并重新接种，可

21、23天重新形成网络，可冻存长期保存。 3 NGF去除： 研究NGF作用 方法：1）先更换培养液4-6次，间隔培养数小时再换2次，吹打细胞，离心漂洗4次，再接种。2） 用抗NGF血清,67,PPT学习交流,PC-12 cells,-NGF,+NGF 9 days,+NGF 9 days,+NGF 14 days,68,PPT学习交流,神经干细胞的分离和培养,NSC可定义为既可以自我更新又可分化为中枢神经系统内所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞。 神经干细胞的来源： 胚胎干细胞 成年的侧脑室下区（SVZ区） 和海马齿状回的颗粒细胞层（SGZ） 成人嗅球神经干细胞 骨髓基质细胞的转分化,69,

22、PPT学习交流,70,PPT学习交流,71,PPT学习交流,72,PPT学习交流,诱导干细胞增殖和分化的营养因子,bFGF 对神经干细胞分裂和增殖具有重要作用 对胎鼠纹状体 海马 人胚胎干细胞的增殖和分化有重要作用。 EGF （表皮生长因子）对干细胞有分裂和增殖作用。 BDNF 使干细胞分化为神经元 CNTF（睫状神经营养因子） 定向分化为胶质细胞。 胶质细胞生长因子： 使干细胞分化为施万细胞 BMP（骨形成蛋白） 与NGF作用可使干细胞成为胶质细胞 T3 少突胶质细胞的前体细胞,73,PPT学习交流,大鼠胚胎海马神经干细胞培养,一、培养用液：PBS-G溶液：含有6g/L葡萄糖的PBS，ph=

23、7.4 N2培养基：DMEM/F12（1：1）混合，添加有29mmol/l 孕酮 ，30 mol/l硒酸钠，100 mol/l腐胺，3.9 mmol/ 谷氨酰胺，5 g/ml 胰岛素， mol/l转铁蛋白。 多聚鸟氨酸溶液：终浓度为 g/ml bFGF ,分装后 -20 C 终浓度为20ng/ml 二、细胞分离和培养步骤 1）孕期16天大鼠 麻醉后腹部用75%酒精消毒，剪开腹腔 取出角状子宫，取出胎鼠。,74,PPT学习交流,2）胎鼠用75%酒精消毒 断头处死，剪开颅腔，解剖显微镜下去除脑膜，分离获取海马组织。 3）海马组织置于 PBS-G 溶液中 吹打40次 机械分离 4） 离心吸除上清得到

24、沉淀，用N2培养液重悬细胞 5）取少量细胞悬液滴于血球计数板上 进行计数。 6）将细胞接种于已经处理过的培养板上。 7）培养液添加bFGF置37 C ，5% CO2 培养 8）3-4天换液一次，培养一段时间传代,75,PPT学习交流,神经干细胞的鉴定：,目前 关于神经干细胞的鉴定还在探讨中，主要有以下几种 Nestin BrdU PSA- NCAM -tubelin vimentin GAL-C A2B5 ，GFAP 此外 还有 CD133 等,神经干细胞的生长方式： 积聚成神经球并向四周扩散,76,PPT学习交流,神经干细胞培养的应用,大大促进了神经发育机制的了解,使一些神经营养因子直接应用

25、于体内细胞的增殖和分化 有效解决细胞来源，免疫排斥，不能长期存活等问题，使自体细胞移植治疗某些神经退行性疾病成为可能。 基因治疗的载体,77,PPT学习交流,78,PPT学习交流,79,PPT学习交流,Samuel I. Stupp, Board of Trustees Professor Department of Materials Science dead cells response to intracellular fluoresce red as a result of the entry of ethidium homodimer-1 Cell survival was dete

26、rmined at (A) 1 day, (B), 7 days, and (C) 22 days in vitro.,The NPC survived the self-assembly process and remained viable in IKVAV-PA,86,PPT学习交流,IKVAV-PA can increase cell body areas and neurite lengths of NPCs,87,PPT学习交流,IKVAV -PA promoted differentiation of the neural progenitor cells into neuron

27、s,NPCs encapsulated in IKVAV-PA differentiated rapidly into neurons, with about 35% of total cells staining positive for -tubulin after only 1 day and persist enhance after 7 days. there was very little GFAP astrocyte differentiation even after 7 days (5%) GFAP expression was significantly greater in cells cultured on PDL- and laminin-coated substrates,88,PPT学习交流,89,PPT学习交流,神经元网络在神经芯片上的定位培养,90,PPT学习交流,神经界面芯片的研究,慕尼黑的Max Plank生物化学研究所的Peter Fromherz和Gunther Zeck将蜗牛神经细胞置于一个硅芯片上，使用微型塑料桩子将它们围在特定位置。邻