酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化

1、酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化,组员：王应龙 王英刚 王志军 吴晓庆 武正芳 2012年11月,【实验目的】,1、了解和掌握乳酸菌菌的菌种特性 2、掌握乳酸菌的分离检测及纯化方法,【实验原理】,乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。大多数不运动，少数以周毛运动。菌体常排列成链。根据细胞形态为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌族（Streptococceae）和乳酸杆菌（Lactobacilleae）。 在1.6%溴甲酚紫牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解

2、圈。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。,【实验材料、仪器与试剂】,实验材料：市售乳酸饮料或酸奶。 实验仪器：保温箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、 培养皿、试管、涂布器、酒精灯等。 实验试剂：脱脂乳试管、脱脂奶粉、5%蔗糖水、 1.6%溴甲酚紫、95%乙醇溶液、酵母膏、 琼脂、无菌水,【实验步骤】,1、1.6%溴钾酚紫牛乳培养基的制备 2、脱脂乳试管的制备 3、酸奶中乳酸菌的分离 4、乳酸菌的检测、纯化培养,（1）、1.6%溴甲酚紫牛乳培养基的制备,配料： （A）液：脱脂奶粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚紫、乙醇溶液1ml， 80灭菌20min。 （B）液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20

3、g ，pH6.8， 121湿热灭菌20min。 操作： （1）、按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，加琼脂溶化，加热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后 倒入250mL的锥形瓶中，贴上标签，在高压锅中灭菌20min。 （2）、灭好菌的A液和B液趁热充分混合，并在酒精灯的附近趁热倒平板。,（2）、脱脂乳试管的制备,直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10g与蔗糖5g，水95g（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115灭菌15min。,（3）、乳酸饮料或酸奶中乳酸菌的分离,（1）、酸

4、奶菌悬液的配制 取1个洁净三角瓶，盛以90ml无菌水；7支试管，各盛9ml的无菌水；加塞包扎于在103kPa 121高压蒸汽灭菌20Min。 将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品10ml加入盛有90ml无菌水的三角瓶中，振摇均匀，即为10-1的样品稀释液。 将7只装9ml无菌水的无菌试管，依次编号1-7，再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管1-6中，稀释混匀便得到10-210-7的稀释液。,酸奶菌悬液的配制,另留一管不稀释留作对照（CK）,（2）、分离方法,A平板划线 接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进 行划操作；划线完毕后，盖

5、上皿盖，倒置放在40恒温培养箱中培 养48小时。,B平板涂布 用无菌移液管分别吸取10-5、10-6、10-7和无菌生理盐水的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的无菌溴甲酚紫牛乳培养基平板中；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20 min；然后倒置于40恒温箱中培养48小时。,（4）、乳酸菌的检测、纯化培养,(1)、初步检测 恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步

6、定为乳酸菌。,（2）、乳酸菌的分离纯化培养 选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40培养8-24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。,【注意事项】,采用溴甲酚紫牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。,【结果与分析】,1、接种不同浓度菌悬液培养基中乳酸菌落数,2、革兰氏染色结果,革兰氏染色结果为蓝紫色，证乳酸菌为革兰氏阳性菌,3、脱脂乳试管检测乳酸杆菌,试管中脱脂牛乳凝固，证为乳酸杆菌,4、初步结果 通过实验，我们可以得出如下结果： 酸奶中乳酸菌称杆状或排成链状，