米曲霉的培养及蛋白质的分析ppt课件

1、曲霉培养和蛋白质分析，1，1，实验目的，固体三角瓶培养曲霉，掌握固体培养微生物的原理和技术，蛋白酶活性分析方法，2，2，实验原理，过程和方法，1，实验原理2，实验过程3，实验方法，3黄酒，白酒，酱油，味增类等领域广泛固体培养方法： (Solid state cultivation ) :主要有散曲法和封摇滾乐曲法。 一些黄酒用曲、红曲和酱油米曲菌培养为散曲法，黄酒用曲和白酒用曲一般采用封摇滾乐曲法。 固体制曲设备：实验室主要用三角瓶或茄子瓶培养的种子的扩大培养可以将蒸制的材料放入竹石版中，接种后在温度和大气湿度控制的培养室内培养，工业上现在主要是厚层通风池制曲，旋转式圆板式固体培养装置在试验推

2、进中的日本，福摩萨已经大规模化、机械化4、固体培养微生物：主要用于霉菌培养，细菌和酵母菌也可采用该方法。 其主要优点是节能、无废水污染。 单位体积的生产效率高。 我国广泛使用的厚层换气固体法培养法，不像空气那样进行除菌处理，培养环境也不能严格无菌化。 染菌问题没有根本解决。 本实验采用的曲霉的生长特性及菌落特征为曲霉属曲霉(Aspergillus )。 菌落开始为白色、黄色，然后由黄褐色变为淡绿褐色，里面无色。 5，2，实验过程，纯化米曲霉种子(单菌落分离)，制成斜面，将斜面菌种放入250ml三角瓶培养种曲，将种曲扩大培养成500ml三角瓶。 用水溶液萃取曲霉培养物，得到粗酶制剂，收集粗酶制剂

3、，测定蛋白酶活性。 6、3、实验方法、曲霉的培养本实验分为坡面种子培养和三角瓶培养两个阶段。 三角瓶培养物在工厂经常被用作一级种子。 试管斜面培养基：豆浆渗出液：加入豆浆粉100克、水500ml，浸渍4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整为5米。 每100 ml豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾元素0.1，硫酸镁0.05g，硫酸铵0.05g，琼脂2克，制成自然pH。 或使用马铃薯培养基：马铃薯200g葡萄糖20g琼脂15-20g是加水至1000ml pH的自然。 7、黑曲霉培养基1 :麸皮80g、小麦面粉(或小麦面粉) 20g、水80ml； 黑曲霉培养基2，豆粕粉10g，麸皮90g

4、，水110ml。 投入厚度：1cm左右灭菌： 120、30-60min； 三角瓶培养基的制备：8，接种及曲霉培养条件：曲霉固体培养的主要控制条件：温度、大气湿度、投入量、基质水分含量。 固体培养前，原料的蒸熟和灭菌是在云同步进行的。 实验室一般采用高压灭菌锅进行，但在工厂，原料煮熟、灭菌和发酵分别采用不同的设备进行。 这个和液体发酵不同。 28-30、培养20小时后，菌丝充满培养基，首次摇瓶，放松培养基，每隔8小时检查一次，摇瓶。 培养时间通常为48-70小时。9、3、实验仪器、设备和材料、恒温孵化机或固体培养室、负压式洁净台、显微镜、柜台、水浴锅、分光光度校正、试管、茄瓶、平板及500ml三

5、角瓶等。 米曲菌种(酱油生产用米曲菌)，10，4，实验分析项目和方法，1，米曲菌培养效果测定：米曲菌孢子订正数(显微镜观察)通常，每克曲(干化学基)孢子数可达到100亿以上，11，2，干物质重量减少的测定，干重量减少发酵前的干重量发酵后的干重量黑曲霉蛋白酶活性的测定，13，3.1原理(1)，林试剂在碱性情况下极不稳定，还原成酚类化合物呈蓝色反应。 (2)、蛋白质分子中具有酚化学基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸及苯丙酸等)。(3)，以干酪素为底物，与酶液反应，经过一定时间后，加入三氯乙酸，终止酶促反应，使其馀正丁酸蛋白沉淀，与水解作用物分离，过滤提取滤液。 用碳酸纳米金属钍碱化，再加入森林试剂使其显色

6、，用分光光度修正进行了测定。 (4)蓝色反应的强弱与蛋白水解作用生成物的多少成比例，水解作用生成物的量与酶活力成比例。 因此，可以根据蓝色反应的强弱推测蛋白酶的活性。 14，3.2试剂(1)森林试剂在2000ml的研口回流装置内加入钨酸钠金属钍(Na2WO42H2O)100g、钼酸钠金属钍(NaMoO42H2O)25g、水700ml、85%磷酸50m1。 溶液中还残留有绿色时，需要滴下元素溴液。 煮沸去除。 蒸发制冷后，定溶至1000ml。 过滤后放入茶色的瓶子中保存。 该溶液在使用时加入蒸馏水2倍稀释，作为稀释后的森林试剂。 15、(2)0.4mol/L三氯乙酸(TCA )溶液称为三氯乙酸6

7、5.4g，定容于1000ml。 (3)0.4mol/L碳酸纳金属钍溶液被称为无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，定容于1000m1。 (4)0.05mol/L pH2.5乳酸乳酸乳酸钠金属钍缓冲液a液：加入蒸馏水，将10.6g80-90%乳酸定容至1000ml。 b液：在16g 70 %乳酸纳金属钍中加入蒸馏水，定容至1000ml。 将16ml液和1 ml b液稀释1倍，形成0.05mol/L pH2.5乳酸乳酸乳酸钠金属钍缓冲液。 16、(5)2%干酪素溶液，将干酪素2g加入0.1mol/L的氢氧化钠金属钍20ml，在水浴中加热使其溶解(根据需要用弱火加热煮沸)，其后，用pH2.5乳酸-乳

8、酸金属钍缓冲液定容至1000ml。 配制后，请立即使用或放入冰箱保存。 细菌容易繁殖，引起变质。 在调制干酪素溶液的定容时，如果泡沫过多，可以加入12滴酒精使其消泡。 3350酸性蛋白酶干酪素溶液的配制是加入乳酸23滴使其湿润。 17、(6)100g/m1正丁酸溶液用l05电烤箱烘烤至恒重的正丁酸0.1g，阶段性地加入0.1mol/L盐酸(HCl )使其溶解，加入蒸馏水定容至100m1，其浓度为1000g/m1。 再将10ml这种液体用蒸馏水定容至100ml，就成为100g/m1酪氨酸溶解液。 配合这种液体后请立即使用，或放入冰箱保存，以免细菌繁殖变质。18、3.3操作步骤、19、3.3.1定

9、标曲线的图，(1)按表制备各种浓度的酪氨酸溶液，(20 )、(2)按测定步骤分别取6根试管，按上表编号分别取浓度不同的酪氨酸1ml，分别加入0.4mo1/L的锅中一般测量3次，取平均值，以吸光率为纵坐标，以正丁酸的浓度为横坐标，制作定标曲线。 21、准确测量蛋白质组研究固体发酵的湿曲2g，用蒸馏水1020ml浸泡30分钟，用滤纸过滤。 将滤液稀释至一定倍数(优选使测定光密度在0.20.4的范围内)。 3.3.2酶液制备，取22，4根试管，分别加入1ml稀释酶液，其中1根为空白管，3根为平行试管，加入40水浴预热35min。 在3根平行试管中分别加入1 ml2%干酪素溶液，正确保温10分钟。 立

10、即加入0.4m三氯乙酸溶液2ml，用l5min滤纸过滤。 分别吸入澄清液1ml，加入0.4m碳酸纳金属钍溶液5ml，最后加入1ml苯酚试剂，进行摇摆，在40水浴中显色20min。 向空白对照管中加入0.4m三氯乙酸溶液2ml，再加入2%干酪素溶液lml，15分钟后用滤纸过滤。 以下操作与平行试管相同。 以空白对照管为对照，在波长680nm下测定测光密度，取其平均值。 3.3.3测定，23，蛋白酶活力单位定义： 40，pH2.5，将对干酪素进行每一分钟水解作用后释放出1微米计程仪拉姆正丁酸的酶催化剂量定义为1个蛋白酶单位。式中： k :定标曲线中的OD值相当于1的酪氨酸的麦克计程仪拉姆数OD :平行试管的平均光密度4 :试管中的反应液的总体积(毫升) 10 :反应10分钟； n :稀释倍数； w :曲量(克)、3.3.4修正算、24、(1)对