细胞培养技术课件

1、浅谈细胞培养技术,陈巧玲 2017-9-17,主要内容,细胞培养前的准备 细胞的原代培养 细胞的传代培养 细胞冻存与复苏 培养细胞的污染,离心机,橱柜,实验台,冰箱,培养箱,试剂柜,实验仪器台,超净工作台,实验台,实验台,实验台,实验台,水池,冰箱,衣柜,实验台,显微镜,递物窗,缓冲间,无菌操作室,准备室,1.细胞培养室设置,一、细胞培养前的实验准备,下风口,上风口,无菌操作室,超净工作台和CO2培养箱,2.细胞培养的主要实验设备,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,CO2培养箱设定的条件

2、为37 ，5CO2 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒 箱内蒸馏水槽中预留灭菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,解剖显微镜,倒置显微镜,2.细胞培养的主要实验设备,血清（天然成分）：,基础培养基（人工合成）：干粉培养基DMEM 、-MEM、RPMI1640,水：高纯度的去离子水,3.细胞培养的主要试剂（培养基）,抗菌素：通常是青霉素和链霉素联合使用，使用浓度为100U/ml,消化液：常用0.25胰蛋白酶，使细胞脱离组织或容器壁， 用含血清培养液中止其活性,4.细胞培养用器皿的清洗和消毒, 一般玻璃器

3、皿的清洗分为四个步骤： 1、自来水浸泡 2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超声处理） 3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水） 4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最后烘干备用,常用消毒方法： 1、湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌），15磅，1520min 2、过滤除菌(如：血清的除菌）,细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，是在无菌条件下，把动物或植物的细胞从机体中分离出来，置于培养皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和繁殖的方法。,细胞培养 （Cell Culture）,细胞培养的基本概念,培养细胞的类型,贴附型 成纤维样细胞型 上皮样细胞型 悬浮型,细胞培养的基

4、本概念,培养人真皮成纤维细胞,培养人口腔上皮细胞,培养的骨髓瘤细胞,贴附型细胞的生长特性,细胞的贴壁生长 接触抑制 细胞的生长曲线,细胞贴壁延展过程(模式图),细胞培养的基本概念,细胞的接触抑制现象,正常培养细胞的生长曲线,退化死亡,平台期,细胞数增大极限点，出现接触抑制,细胞指数生长极限点,指数生长期,潜伏期,细胞数量,0,24,48,72,96,120,小时,指数生长期是最佳实验期 !,原代培养，或称为初代培养，就是从供体取下组织细胞后在体外进行的首次培养，中途不分割培养物。常用的原代培养方法有组织块培养法和消化培养法。,二、原代培养,实验准备 取材、分离细胞 原代培养 维护培养,小鼠胚胎

5、成纤维细胞的原代培养,着装,操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，然后用1 新洁尔灭浸泡消毒5分钟,原代培养的一般流程,原代培养的一般流程,小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养,将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。,用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥向肾门，去肾外膜及脂肪,实验准备 取材、分离细胞 原代培养 维护培养,实验准备 取材、分离细胞 原代培养 维护培养,小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养,原代培养的一般流程,组织块培养法,原代培养方法,消化法,原代培养流程图：组织块法,原代培养流程图：组织块法,原代培养流程图：消化法,原代培养流程图：半消化法,小鼠胚胎成纤维细

6、胞原代培养,三、传代培养,传代培养，在原代培养物铺展为单细胞层后，将原代培养细胞分开接种到两个或多个新的培养瓶中继续培养增殖。,细胞的传代培养,将原代培养物分割后重新接种到两个或多个培养瓶内进行培养，这一操作称为传代培养,传代比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异. 细胞传代培养的意义 传代时机的把握 传代培养的代数限制；少数细胞可出现永生化,吸去旧液,加入消化液 解离细胞约5min,在倒置显微镜下观 察，细胞呈圆粒状,细胞的传代培养：贴附型,PBS洗 涤 12次,吹打悬浮细胞,调整细胞密度,分装接种，置于CO2 培养箱中继续培养,在培养瓶中加入 适量含血清培养液,培养细胞 的观察,细胞的传代

7、培养：贴附型,培养细胞 的观察,培养液颜色、是否清亮,培养细胞的状态,细胞的传代培养：贴附型,吸去旧液,加入消化液 解离细胞约5min,在倒置显微镜下观 察，细胞呈圆粒状,PBS洗 涤 12次,吹打悬浮细胞,调整细胞密度,分装接种，置于CO2 培养箱中继续培养,在培养瓶中加入 适量含血清培养液,培养细胞 的观察,吸去旧液,加入消化液 解离细胞约5min,在倒置显微镜下观 察，细胞呈圆粒状,细胞的传代培养：贴附型,PBS洗 涤 12次,吹打悬浮细胞,调整细胞密度,分装接种，置于CO2 培养箱中继续培养,在培养瓶中加入 适量含血清培养液,培养细胞 的观察,中止消化、吹散细胞,离心，收集细胞,细胞计数，调节密度,按比例分割，接种至新培养瓶,细胞的传代培养：悬浮型,四、细胞的冻存与复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞间的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、减少经费、减少污染、减少细胞生物学特性变化，最大限度的保存细胞活力。,细胞冻存与复苏的原则：慢冻快融,低温保护剂的应用,细胞冻存方法,程序降温仪,细胞冻存盒,五、培养细胞的污染,所有混入培养环境中对细胞生存有害的成分和 造成细胞不纯的异物。 微生物 细胞 化学物质,微生物污染的检测,污染的检测,真菌污染,细菌污染,