白喉疫苗工艺流程菌种.ppt

1、细菌性疫苗,杨丽华 2011年3月,1. 死疫苗,2. 活疫苗,3. 蛋白类疫苗,4. 多糖类疫苗,5. 多糖蛋白结合疫苗,细菌性疫苗,国药长春所,细菌性疫苗种类,国药长春所,国药长春所,白喉疫苗,一、白喉概述 二、病原学 三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学 四、白喉毒素 五、白喉类毒素 六、生产工艺 七、类毒素的质量检定,国药长春所,外毒素 对神经 系统损 害,细菌产生 的外毒素 对心肌损 害,外毒素 对肾脏 损害,白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。 它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病,主要临床表现为上呼吸道发炎， 常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，,白喉疫苗,国药长春所,

2、白喉流行特点,1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌 没有中间宿主，病人及带菌者是唯 一的传染原。 2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。 3.易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1岁时 白喉易感性达高峰。,国药长春所,二、病原学,1.细菌形态 白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈 棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰 氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚 膜，不形成芽孢。,国药长春所,白喉棒状杆菌显微镜下形态,国药长春所,国药长春所,白喉棒状杆菌显微镜下形态,2.培养特性 白喉杆菌是需氧菌，最适温度为3435。能分解 葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸 盐，不产

3、生吲哚，不消化蛋白。 3.抵抗力 .白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和 红霉素极敏感。 .对消毒剂抵抗力弱，3苯酚10min可将该菌杀死 .不耐热，58 10mi或100 1min即可被杀死。,国药长春所,二、病原学,三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学,1. 致病力 自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成 人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验 室常用的动物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。 2.毒素产生遗传学 白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。 白喉杆菌的产毒基因是由嗜菌体携带。 嗜菌 体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体DNA与细菌DNA整合， 形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力

4、（PW8株目前 用于白喉类毒素生产)。,国药长春所,四、白喉毒素,1.白喉外毒素为棒状杆菌-噬菌体tox基因表达 产物,可与细胞表面的特异性受体结合,干扰蛋 白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性， 如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均 受到损害。 2.白喉毒素是单一多肽，由560个氨基酸组成， 分子量为62kDa,等电点pH4.1，在pH6时加热55 很快失活。 3.通过物理和化学方法将其纯化。,国药长春所,毒素经甲醛处理后去除毒性 而保留免疫原性,五、白喉类毒素,国药长春所,甲醛 浓度,PH,脱毒,影响脱毒因素,国药长春所,温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果,.温度越高脱毒越快，超过

5、40影响抗原性， 一般3738 。 .在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在 保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱 毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱 毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。 .甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。,国药长春所,温度升高 游离甲醛的浓度低 毒素纯度高,提高甲醛浓度、脱毒pH、 脱毒温度和延长脱毒时间； 增加非蛋白氮含量（于精制 毒素中加入赖氨酸、精氨酸等）,类毒素的毒性逆转,国药长春所,六、白喉疫苗工艺流程 菌种（ PW8株 ） 传代扩增 34代 发酵罐培养 3435培养对数生长 末期收获，甲苯杀菌。 离心去菌体 收集清液 超滤浓缩 硫酸铵两段盐析 除盐除

6、菌 氨离子及无菌检查 脱毒 甲醛液 37 脱毒试验（家兔） 原液 检定（浓度、纯度、安全等） Al(OH)3吸附 成品 检定（安全、效价等）,国药长春所,七、类毒素的质量检定,1 絮状单位（Lf） 是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量” 而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类毒素的絮状单位。 絮状单位测定 毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应， 根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位（Lf）值。 2 纯度：1500Lf/mgPN 3 安全性试验（豚鼠）,国药长春所,七、类毒素的质量

7、检定,4效价测定 类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗 体的特异性结合反应。 小鼠Vero细胞法 将标准和待检类毒素2倍稀释35个稀释度，皮下免疫N IH小鼠8只（0.5ml/只)，免疫5周采血，根据vero细胞 生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进 行结果计算。 豚鼠毒素攻击法 皮下免疫豚鼠10只（1ml/只），免疫4周后用毒素攻击， 观察5天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分 析法进行结果计算。,国药长春所,百日咳疫苗,一、百日咳概述 二、病原学 三、百日咳疫苗发展简史 四、无细胞百日咳疫苗 、生产工艺流程 、质量检定 、APV的效果 、接种不良反应,国药长

8、春所,急性脑炎、呕吐、痉挛和昏迷，死亡或脑损伤,并发症肺炎 形成肺气肿 肺不张，甚 至死亡。,营养缺 乏症,百日咳是对儿童威胁非常大的传染病， 它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。,典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾 声或伴有呕吐，可持续数月。,百日咳概述,国药长春所,百日咳流行特点,1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳 病人是传染原。 2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。 3.易感人群：主要传染对象是6岁以下儿童，1 岁以内婴幼儿发病率50%。,国药长春所,二、病原学,细菌形态 百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形,国药长春所,生长特性,1

9、.百日咳菌可分四种相变，相菌毒力最强有免 疫原性；相菌毒力消失，无免疫原性； 相菌介于 相之间。 2.百日咳菌是需氧菌，最适温度为3536,最 适pH6.8-7.0。 3.不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液 化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。,国药长春所,1百日咳相菌有两大类抗原 菌体O抗原 表面K抗原（荚膜物质） 2百日咳菌可产生 外毒素(PT) 内毒素 其他生物活性物质，据报道有25种之多。,、主要抗原和生物学活性,百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 重患 (FHA PT PRN Agg) 下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 细菌不进入组织和血液循环 干扰吞噬细胞功能 AC 分泌大量P

10、T 麻痹上皮细胞功能 TCT 产生血细胞增多 损伤支气管血管周 HLT 细胞代谢发生变化 组织胺致敏性增强 围组织 分泌胰岛素增强和 血糖降低.,、致病机理,国药长春所,三、百日咳疫苗发展简史,粗制百日咳灭活疫苗 第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其 与 致病机理间的关系缺乏认识的前提下，凭经验制造的灭活 疫苗，工艺粗造、含量不确定。 全菌体百日咳疫苗(WPV) 以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有123型凝 集原（Agg1、Agg2 、Agg3）。经过50多年的临床应用证 明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反应问题 一直未解决。 无细胞百日咳疫苗(APV) 20世纪8

11、0年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学 作用的认识，产生了APV。 基因工程疫苗正在研究中。,国药长春所,四、无细胞百日咳疫苗,1981年日本的佐藤教授等人在纯化出PT和FHA两种抗原的基础 上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百 日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破 联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取 代了菌体百白破疫苗。 1992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国 获得生产许可证的APV还含有Agg2和PRN。目前WHO已经将其作 为儿童预防免疫推荐用疫苗。 我国是于80年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，90年

12、代 中期获得正式生产文号。 近期的临床试验证明含有5种保护性抗原（PT FHA PRN Agg2 A gg3 ）的APV效果最佳。,国药长春所,冻干百日咳菌种（相CS菌株） 接种血培养基大管培养 36 48-72小时培养 传代 接种发酵罐培养（综合培养基） 培养48小时 收集培养物 第一段硫酸铵盐析及浸提 第二段硫酸铵盐析及浸提 透析 密度梯度离心 戊二醛脱毒 透析 超声 无细胞百日咳原液,、生产工艺流程,国药长春所,、质量检定,国药长春所,日本和中国的APV和DTPa按以上主要检定项目进行质量 控制。 美国、欧洲一些国家及WHO推荐的毒性和效价测定方法 等与之不同。毒性试验仅要求做HST，效

13、价测定采用EL ISA法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。 用小鼠脑腔保护力试验（MPT）评价疫苗效果，WPV 的 效价明显高于APV，而且并非所有的APV均可通过MPT试 验。因此还没有令人满意的针对APV疫苗的效价试验方 法。 免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有用的，但 与临床保护之间还缺乏相关性。,国药长春所,效价测定方法探讨,表明APV的保护效果是肯定的，能够达到WPA的保护水平。,、APV的效果,国药长春所,表明APV的不良反应明显低于WPV。,、接种不良反应,国药长春所,伤寒疫苗,一、概述 二、病原学 三、伤寒疫发展简史 四、伤寒Vi疫苗,国药长春所,1.伤寒病是一种急性全

14、身性感染，感染网状内皮细胞系统，肠道淋巴组织及胆囊，病原是伤寒沙门氏菌。 2.传播途径是食入被污染的食物或水源。 3.学龄儿童发病率最高，两岁以下儿童和35岁以上成人发病率低。,一、 概述,国药长春所,典型的临床症状,国药长春所,二、病 原 学,1.细菌形态 伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌， 有鞭毛，能运动。,国药长春所,伤寒沙门氏菌革兰染色,国药长春所,伤寒沙门氏菌电镜形态,国药长春所,2.培养特性 在肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基上以易生长，需氧，适宜温度35-37，适宜的pH为7.07.2。 发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；不发酵乳糖、蔗糖；氧化酶试验阴性。,1.鞭毛（H）抗原

15、：为蛋白质，煮沸破坏，不受 （1）甲醛影响。 2.菌体（O）抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多 糖（LPS）由多糖（重复寡 糖和核心寡糖）和类脂A组 成。 3.莢膜（Vi）抗原:即荚膜多糖（CPS）,是伤寒 杆菌细胞外壁的一种荚膜抗 原, Vi抗原与其致病性有关 Vi来源于毒力的缩写。,抗原结构,国药长春所,血清学诊断,1.肥达氏试验（widal test） 选择抗原的方法： .测定O抗体 用伤寒0901株（没有H和Vi抗原） 用加热杀菌破坏H抗原（不耐热） .测定H抗体 用伤寒S株（没有O菌体抗原） 用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏O抗原 2.酶联免疫试验,国药长春所,1,2,3,4,全菌 体灭 活疫

16、 苗,口服 Ty21a 减毒 活疫 苗,伤寒 Vi多 糖疫 苗,伤寒 结合 疫苗,二、伤寒疫苗的发展简史,国药长春所,1甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗,2.加热杀菌石碳酸防腐疫苗,3.丙酮杀菌疫苗,、全菌体灭活疫苗,国药长春所,甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗,50年代初期学自前苏联，为伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗。用甲醛杀菌，0.5石炭酸生理盐水制成。每毫升含伤寒沙门氏菌体原为1亿-亿；副伤寒甲乙由每毫升各亿-.5亿，细菌总量原三联疫苗为20亿-10亿。,国药长春所,加热杀菌石碳酸防腐疫苗,此法历史最久，1896年首创的伤寒疫苗即为此法制成，只用56水浴30in杀菌加石碳酸防腐制成。美国仍用此法制作标准品。,国药

17、长春所,丙酮杀菌疫苗,1921年创制，认为对稳定Vi抗原有益，系将一份菌液加三份丙酮处理，然后抽气 干燥制成。1943年首次在意大利使用，经 世界卫生组织做现场考核，认为效果最好。,国药长春所,伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗接种反应,实践证明，菌体疫苗预防伤寒效果肯定的，但接种后的严重反应一直困扰着人们。,国药长春所,、口服Ty21a疫苗,70年代末期研究成功的口服伤寒疫苗Ty21a活疫苗，是以Ty21伤寒毒株作为出发株，用亚硝基胍诱变所得的突变株。,国药长春所,口服Ty21a疫苗的特点,1.减毒活疫苗 此突变株缺少尿苷二磷酸半乳糖-4-异构酶半乳糖 激酶和半乳糖1-磷酸尿苷酰转移酶的活性降低约8

18、0。 且没有Vi抗原。所以其毒力减低，但此突变株有 完整的O抗原LPS，并具有免疫原性，能诱导较好 的免疫保护性反应。 2.经过多年观察证明有效，反应也较轻。一些国家 批准应用。,国药长春所,口服Ty21a疫苗的特点,3.Ty21a菌株营养要求苛刻，生长缓慢， 产量很低，不易批量生产。 4.目前无可靠的检定指标。 5.基因背景不够清楚，因为它是用强诱变 剂处理而得，作为活疫苗这是它的最大 的弱点。,国药长春所,口服Ty21a减毒活疫苗的免疫效果,国药长春所,、 伤寒Vi多糖疫苗,1.伤寒Vi多糖疫苗的概述 2.伤寒Vi多糖疫苗的免疫效果 3.伤寒Vi多糖疫苗不良反应观察结果 4.伤寒Vi多糖疫

19、苗的制造工艺 5.伤寒Vi多糖疫苗的特点,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗概述,由于Vi抗原是一种表面抗原，是由C3位乙酰化的 N-乙酰-D-半乳糖醛酸（14）连接的同聚体。 在美国NIH的Robbins等重新认识伤寒Vi抗原的免 疫原性后，并受流脑多糖疫苗的启发，用与之类 似的方法提取Vi抗原，以不伤害其抗原结构，保 持它的免疫原性，制备了伤寒Vi多糖疫苗。,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗概述,早期提取Vi 抗原时为了降低LPS的含量， 采取1mol/L乙酸100处理24h，使O-乙酰 基和N-乙酰基脱落造成Vi抗原结构变化， 导致其免疫原性发生变化。 新方法是用十六烷基三甲基溴化铵处理伤 寒沙门

20、氏菌，所得Vi抗原可以保留O-乙酰 基和N-乙酰基，使其不变性。,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗的免疫效果,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗不良反应观察结果,国药长春所,（Ty2株） 细菌培养 生物反应液体培养（810h） 对数生长期末收获,甲醛液灭活 离心去菌体，收上清液 浓缩多糖 上清加10%十六烷基三甲基溴化铵 离心收集沉淀，加氯化钙溶液振荡解离 除去核酸 加95%乙醇至25%浓度收集上清 上清中加95%乙醇至80%浓度 沉淀粗制多糖，抽干 除去蛋白 加1：10饱和中性醋酸钠溶液溶解多糖 按1：2加冷酚提取3次，离心收集上清 液并透析 沉淀多糖 透析液加95%乙醇至80%沉淀多糖 用无水乙醇和

21、丙酮各洗3次 原液 注射用水溶解多糖并除菌 注射用水稀释分装 成品,伤寒Vi荚膜多糖疫苗工艺流程,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗检定项目及检定指标,国药长春所,伤寒Vi多糖疫苗的特点,安全有效 副反应较菌体疫苗轻，但却 有其大致相同的免疫效果。 稳定性好 即可以为液体制剂，也可以 为冻干制品，耐热，易于运输与保存。 使用方便 注射一针，即可以有一定的 保护力，易于用理化方法标准化。 同其他多糖疫苗一样对婴幼儿免疫效果 差。,国药长春所,结合疫苗,一、结合疫苗的特点 二、免疫机理 三、用于制备结合疫苗的多糖抗原 四、用于制备结合疫苗的蛋白载体 五、结合化学制备结合疫苗的主要要素 六、结合疫苗应具备

22、的两个共同特征 七、结合疫苗的使用和发展现状 八、结合疫苗的研究方向 九、存在问题,国药长春所,一、结合疫苗的特点,1.抗原物质（多糖和蛋白质）经化学共价结合形成 了具有一定空间构象的结合物。 抗原物质还包括多肽、甾族激素、脂肪胺、核苷 等小分子物质。 2.它能使多糖抗原的T细胞非依赖性转化为T细胞依 赖性,产生具有记忆特征的IgG抗体,提高多糖疫苗的免疫原性和免疫持久性。 3.能够在婴儿产生免疫应答。,国药长春所,二、免疫机理,1.胸腺非依赖性抗原（TI-Ag） 2.胸腺依赖性抗原（TD-Ag）,国药长春所,胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）,细菌脂多糖、荚膜多糖等。 TI-Ag分子结构呈长链，

23、O-乙酰基、丙酮酰基、糖苷键和 磷酸脂键等抗原表位重复排列而成簇，对每种表位来将 可视为多价的，能与B细胞表面受体结合形成“帽状现象”。 可单独触发B细胞产生抗体，不需T辅助性细胞辅助。 与TI-Ag发生应答的是B细胞的抗原识别受体IgM（B细胞成 熟的标志），产生的抗体仅为IgM,且抗体效价低、无Ig类 型转换。 不诱导细胞免疫应答，也不引起免疫记，即使再次采用相 同抗原刺激也不能引起初次免疫应答，更无抗体亲和力成 熟过程。,国药长春所,TI Ag,B,IgM,无记忆B细胞（Bm）形成，不产生加强应答，因而免疫原性弱。,B细胞对（TI-Ag）应答特点,国药长春所,胸腺依赖性抗原（TD-Ag）

24、,绝大多数天然抗原（蛋白质）都是TD-Ag。 TD-Ag分子量大，结构复杂，表位种类多且不均匀(就每 种表位而言它是单价的)。 此类抗原含有T细胞和B细胞决定簇，蛋白质通过单价表 位的相互作用与B细胞表面IgM受体结合，但不诱导“帽 状现象”，不足以激活B细胞,但被B细胞胞饮、水解后肽 表位与T细胞受体结合诱导TH细胞产生细胞因子。 TD-Ag需TH细胞产生细胞因子并激活B2细胞产生抗体,浆 细胞在产生抗体中发生Ig类型转换，合成IgG和IgM类抗 体。 形成记忆Bm细胞，当受到相同抗原再次刺激时引起再次 应答，而且抗体亲和力较初次应答明显提高。 诱导体液免疫应答，同时诱导细胞免疫应答。,国药

25、长春所,TD-Ag,IgG IgM,记忆B细胞（Bm）形成，产生加强应答，增强免疫原性。,B细胞对（TD-Ag）应答特点,国药长春所,多糖蛋白质结合物（TD-Ag）,将多糖分子与蛋白质共价结合，由于蛋白质 抗原激活TH细胞，能诱导TH细胞产生细胞因子 （如r-IFN,IL-2、4、5）并传递给B2细胞，使 之参与免疫应答。 TD-Ag应答存在着TH-B2细胞间的协作作用,国药长春所,多糖蛋白质结合物（TD-Ag）,多糖蛋白质结合疫苗免疫优势: 1.有TH细胞参与，刺激机体产生的抗体 主要有IgG和少量IgM，能产生细胞免 疫和加强免疫应答，免疫原性强。 2.免疫接种范围广，对所有年龄组人群 均

26、能提供免疫保护。,国药长春所,抗体生成的辅 助细胞专一地 识别载体决定簇,TH细胞,B2细胞,是产生抗体的效应细胞 专一地识别多糖（半抗原） 表面抗原识别受体为IgG和IgM 产生IgG和IgM。 分化增殖过程中有少量B细胞 停止分化变成记忆Bm细胞 出现加强应答免疫原性大大提高,TD-Ag,TD-Ag应答存在着TH-B2细胞间的协作作用,国药长春所,一类是细菌的荚膜 多糖（CPS）,A/C群脑膜炎球菌,肺炎链球菌,b型流感嗜血杆菌（Hib）和伤寒杆菌,三、用于制备结合疫苗的多糖抗原,国药长春所,另一类为菌体多糖 （OPS）,脂多糖（LPS）中 的O特异性多糖（O-PS）,脂寡糖（LOS） 中

27、的寡糖（OS）,纯化的O-PS和OS没有免疫原性，与蛋白载体制备结合疫苗后可获得免疫原性。抗O-PS的IgG具有 型特异性保护，抗OS抗体具有杀菌活性及免疫保护作用。,三、用于制备结合疫苗的多糖抗原,国药长春所,四、用于制备结合疫苗的蛋白载体,1.细菌的分泌性毒素（去除毒性） 破伤风类毒素（TT） 白喉类毒素（DT）及无毒 CRM197 百日咳毒素（PT）及无毒CRM3201 霍乱肠毒素（CT）及其B亚单（CTB） 无毒的重组绿脓杆菌外毒素（rEPA） 大肠杆菌热敏感肠毒素（HLT） 2.细菌菌毛 绿脓杆菌菌毛（PAP） 淋球菌P-3-2菌毛,国药长春所,四、用于制备结合疫苗的蛋白载体,3.细

28、菌外膜蛋白 B群脑膜炎球菌外膜蛋白（OMP） 4.病原蛋白质 如乙肝表面抗原（HsAg） 5.B群脑膜炎球菌外膜蛋白（OMP） 6.伤寒杆菌鞭毛和肺炎球菌溶血素（PLY）也是 很有潜力的结合蛋白。 7.人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚赖氨酸,国药长春所,1.多糖抗原的选择 细菌的保护性抗原 荚膜多糖（CPS） 菌体多糖（OPS） 2.多糖分子大小选择 天然多糖 经降解后的寡多糖。,五、结合化学制备结合疫苗的要素,国药长春所,3.载体蛋白的选择 破伤风类毒素（TT） 白喉类毒素（DT） 4.多糖和蛋白质活性功能基团 天然的 修饰的 5.结合模式,五、结合化学制备结合疫苗的要素,国药长春所,4.

29、偶联反应可利用的化学功能团,国药长春所,按照结合方法可分为两种结合模式 两种抗原的直接结合 一般限于羧基和具有一级氨基醛基之间的缩合反应，其产物需要进一步还原才能稳定。 两种抗原通过化学双功能连接剂的结合 在多糖和载体蛋白之间使用一个连接物，不但可增加结合物的收率，而且可大大增强其免疫原性。现有的连接剂按其性质可分为两种。,5.结合模式,国药长春所,5.结合模式,异种双功能连接剂：SPDP（-琥珀酰 胺-3-二硫 代呲啶丙酸） 同种双功能连接剂 AH（已二酰肼） EDAC(碳二亚胺) 戊二醛。 不同的连接剂所带的活性功能团不同,因而要求抗原中相应不同的活性功能团与之反应。,国药长春所,5.结合

30、模式,按照多糖蛋白质偶联物的分子构象 分为两种连接模式 末端连接模式 交叉连接模,国药长春所,5.结合模式,末端连接模式 一个载体蛋白上可连接一定数量的糖链，每一条糖链上只有一个末端位点与蛋白质结合，糖链与蛋白质载体可以直接连接，也可以通过小分子桥连接。,5.结合模式,交叉连接模 该模式的每一个载体蛋白或每一个糖链上都可以 有多个相互连接位点，结合物形成网状交连体。 随着糖链长度的延长，连接点的增加，交连体的 分子质量会相应增大，其三维空间结构更为复杂.,国药长春所,结合疫苗制备常用的四种化学结合方案,国药长春所,1.氨基还原法（直接结合）,糖类在水溶液中大多以环状半缩醛形式 存在，在氨基存在的情况下与之形成shi ff氏碱。 用还原剂将氨基还原成二级亚胺, 从而 形成稳定的多糖蛋白结合物 。,国药长春所,3.CNBr-ADH 酰胺化反应法,在碱性条件下用CNBr活化多糖分子上的羟基 （-OH）形成氰酸脂