修订版-2脲酶样品的含量测定.ppt

1、酶(蛋白质)工程学科实验2尿素酶的蛋白质含量测定，云南大学生命科学学院生命技术专业系统实验(4)，地图教师：陈慧星(138-8809-8105)李彩河(158-8782-6613)，蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用的最基本的分析方法之一。目前有四种常用的茄子方法：凯式氮法、双轴法、福林酚试剂法(Folin法)和紫外线吸收法。此外，还有近十年来普遍使用的新测量方法科马斯亮蓝色-G250法(Bradford法)牙齿。其中布拉德福德法和劳里法灵敏度最高，比紫外线吸收法敏感1020倍，比Biuret法敏感100倍以上。凯氏氮法比较复杂，但比较准确，常用凯氏氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白。

2、你的茄子方法在任何条件下都不能应用于任何形式的蛋白质。因为一种茄子蛋白质溶液是用牙齿四茄子方法测量的，所以你的茄子会得到不同的结果。每种测量方法都有优缺点。选择方法时，请考虑以下方面：测量实验所需的灵敏度和准确度。蛋白质的性质溶液中存在的干涉物质；测量所需的时间。Bradford法试剂配方简单，操作简便，反应灵敏，灵敏度比Lowry法高4倍，测定微克级蛋白质含量，以01000g/ml测定蛋白质浓度范围是常用微量蛋白的快速测定方法。由于它的突出优点，应用越来越广泛。Bradford方法的突出优点是1 .据推算，灵敏度高的：比Lowry法高约4倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。因为蛋白质和染料结合

3、后产生的颜色发生了很大变化，蛋白质染料复合物具有更高的消光系数，光吸收值随着蛋白质浓度的变化远远大于Lowry法。2.测量快速简便，只需添加试剂。完成样品测量需要5分钟。染料和蛋白质相结合，大约2分钟就能完成，其颜色在1小时内可以稳定，5到20分钟之间颜色稳定性最好。因此，完全没有必要像劳里法那样耗费时间和严格控制。3.干扰物质较少的：干扰Lowry法的K，Na，Mg2离子，Tris缓冲液，糖和甘蔗，甘油，巯基乙醇，EDTA等都不干扰牙齿测定法。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，可以用适当的缓冲液调节其影响。Tris、乙酸、2巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA和Triton X100、SDS、玻璃

4、洗涤剂等微量洗涤剂具有一定的颜色干涉，可以通过适当的缓冲液轻松去除。但是大量洗涤剂的存在对颜色影响太大，不能轻易去除。缺点：1。由于不同蛋白质中精氨酸和芳香氨基酸的含量不同，布拉德福德法根据蛋白质测定有很大偏差，在制作标准曲线时，通常使用球蛋白作为标准蛋白质，减少牙齿方面的偏差。2.还有些物质妨碍了牙齿方法的测定。主要干扰物质是洗涤剂，Triton X-100，12烷基硫酸钠(SDS)，0.1N的NaOH。(就像0.1N的山妨碍了Lowary方法一样)。3.标准曲线也有一些非线性，不能用Beer定律计算，只能用标准曲线测量未知蛋白质的浓度。2，基本原理，2.1测定酶液样品中蛋白质浓度的意义，了

5、解酶含量，指导酶的研究、生产、改造和应用。结合酶活力测定结果，计算酶的活性，用于评价酶样品的纯度和活力大小。2.2科马斯亮蓝G-250结合法测定蛋白质含量的基本原理也称为布拉德福德法，布拉德福德建立于1976年。komas亮蓝色G-250可在酸性溶液中与蛋白质的疏水区域(主要是碱性氨基酸和芳香氨基酸残基侧链)结合。柯马斯亮蓝色G-250的磷酸溶液为棕色，最大吸收棒为465nm。与蛋白质结合形成复合物会变成蓝色，最大吸收棒会变成595nm。在一定范围(10100g/ml)内，comas亮蓝色G250-蛋白质复合物上色后，595nm处的吸光度A595与蛋白质含量呈线性关系，可以用于蛋白质浓度的测定

6、。3，仪器试剂，3.1设备和耗材旋涡搅拌机试管，吸管，容量瓶，两筒移动器，移动气吸头分光光度计电子分析天平计时器，3.2试剂磷酸盐缓冲液：0.2米pH7.0磷酸盐缓冲液100毫升。标准蛋白溶液：10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)溶液，正确提取BSA 1g，用上述磷酸盐缓冲液溶解，稀释到100ml。测试大气酶样品液：实验1测定酶活性后剩下的酶液。绝对乙醇。磷酸(即市面上质量浓度为85%的磷酸，比重为1.69)。comas亮蓝色染液：0.01% comas亮蓝色G250溶液，准确地取0.01g comas亮蓝色G250，加入5ml无水乙醇，充分振动搅拌，加入10ml磷酸，蒸馏水加到100ml。反

7、复过滤5次。4，实验阶段，阶段1标准曲线的制备用移动枪，分别将10ul、20ul、40ul、60ul、80ul、100ul的10mg/ml的BSA溶液放入1.5ml的EP管内，分别放入990ul的浓度为0.1mg/ml用移动液枪分别去除100ul之前步骤中配制的BSA溶液，在1.5ml的EP管中分别加入900ul的PBS溶液，振动使溶液均匀混合。将浓度分别为0.01 mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.1mg/ml和0.1mg/ml的BSA溶液集分别求出为1ml。另外，用空白对照法测定1毫升PBS溶液(BSA溶液浓度0 mg/ml)。

8、4，实验阶段，Step1标准曲线的制备，提取7个干净的试管，按照下表按编号顺序加入试剂。混合，室温正立3min，1管为空，波长595nm非比色读取吸光度，吸光度A595为垂直坐标，将每个标准液浓度(mg/ml)绘制为横坐标标准曲线。步骤2酶样品中蛋白质浓度的测定，取了另外4个干净的试管，编号8，9，10，11。分别加入适当稀释的样品液，用磷酸缓冲液稀释。8:实验第一阶段萃取尿素酶原液0.1ml 0.9ml PBS 9:实验第一阶段萃取尿素酶原液0.01ML 0.99ML PBS 103360实验第一阶段丙酮沉淀后尿素酶0.1ML 0.9ML PBS 113360实验第一阶段丙酮沉淀后尿素酶0.01ML 0.99ML PBS溶液充分混合稀释样品液的吸光度标准曲线乘以稀释倍数，就可以得出要测定的酶样品的蛋白质含量(浓度)，5，计算结果，5.1计算方法1根据酶样品测定结果的吸光值，从绘制的标准曲线中计算出相应的蛋白质浓度，然后乘以酶样品的稀释倍数。 5.2计算方法2根据绘制的标准曲线列出线性方程，然后根据酶样测定结果