分子克隆工具酶-13级.ppt

1、第三章 分子克隆工具酶,第一节 限制性内切酶 第二节 甲基化酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 其他分子克隆工具酶,第一节 限制性内切酶,一、限制与修饰 二、限制酶识别的序列 三、限制酶产生的末端 四、线性DNA末端对酶切的影响 五、酶切反应条件 六、酶切位点的引入,一、限制与修饰,细菌的限制与修饰系统(R/M系统) 由限制酶（限制性核酸内切酶）和修饰酶（甲基化酶）组成。 R / M系统的作用：保护自身的DNA不受切割；破坏外源DNA使之迅速降解。 噬菌体在不同宿主中的转染频率。（见p17） 实验说明：K菌株和B菌株中存在一种限制作 用，可排除外来的DNA.,限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳

2、定的保护机制,识别自身遗传物质和外来遗传物质,AN6-MeA C5-MeC,限制酶的发现 美国约翰.霍布金斯大学的H.Smith于1970年偶然发现，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coli DNA，但不能降解自身DNA，从而找到Hind II限制性内切酶。 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。 限制酶的生物学功能 用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细

3、胞中。,限制酶的种类 型酶 (种类很少，只占1%) 三亚基双功能酶，分子量较大，反应需Mg2+、ATP 有特异识别位点但没有特异切割位点 型酶 (占90%以上) 分子量较小，反应只需Mg2+； 识别位点是一个回文对称结构，切割位点在回文对称结构上； 多数型酶切割DNA后形成粘性末端 型酶 (种类更少，不到1%) 二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3端2426 bp处切开DNA，切割位点没有特异性。,限制酶的命名原则 第1个字母：大写，来自微生物属名第1个字母 第2和3字母：小写，来自微生物种名前两个字母 其它字母：大写或小写，来自微生物菌株号 罗马数字：该菌株发现的限制酶的编号 例：E

4、coR I 来源于Escheria coli RY13的第一个限制酶，其识别序列为：GAATTC；,二、限制酶识别的序列,识别序列的长度 一般为48个碱基，最常见的为6个碱基. 4 bp识别序列：Sau3AI GATC 5 bp识别序列：EcoR CCWGG (W=A/T) 6 bp识别序列：EcoR GAATTC 7 bp识别序列：BbvCI CCTCAGC 8 bp识别序列：NotI GCGGCCGC 当DNA中可识别的序列在完全随机的情况下： 识别序列为4个碱基时，平均每256个(44)碱基中会出现一个识别位点； 识别序列为6个碱基时，平均每4096个(46)碱基中会出现一个识别位点。,

5、识别序列的结构 大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。 限制酶切割的位置 大多数在识别序列的内部，如EcoRI、SmaI等； 但也有在外部的：有两端、两侧和单侧之分，如Sau3AI (GATC)。,三、限制酶产生的末端,限制酶产生黏性末端 在对称轴5侧切割底物，DNA双链交错断开产生5突出黏性末端，如 EcoR I； 在3侧切割，则产生3突出黏性末端，如Pst I；,限制酶产生平末端 在回文对称轴上同时切割DNA两条链，产生平末端，如Hpa。 限制酶产生非对称突出末端 当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如BbvC的识别切割位点如下： CCTCAGC

6、GGAGTCG,同裂酶：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。 同序同切酶：识别序列和切割位置都相同 Hpa与Msp识别切割位点为CCGG Mob与Sau3A识别切割位点为GATC 同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同 Kpn：GGTACC Acc65：G GTACC “同工多位”酶：识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。 EcoR I：GAATTC Apo I: RAATTY (R=A/G Y=C/T),同尾酶 可产生相同的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。 EcoR： GAATTC Apo I: RAATTY Mfe I: CAATTC 稀切酶

7、 有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制酶称为稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。,四、线性DNA末端对酶切的影响,DNA末端长度的影响 限制酶切割DNA时，识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则难以发挥切割活性。 一般在识别序列末端有3 4个碱基对时能满足常规的酶切需要。,位点偏爱(site preference) 某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同的切割效率，这种现象称作位点偏爱。 pBR322质粒上有4个Nar位点，在标准条件下1单位Nar可在1h内将2个位点完全切割，但另外2个位点在50单位16h内也不能切割完全。 造成位点偏爱的原因 在切割DNA之

8、前需要同时与2个识别位点作用； 在要切割的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点。,五、酶切反应条件,缓冲液 包括Tris-HCl、Mg2+、DTT、BSA(小牛血清蛋白) 限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低3种类型 H Buffer (100 mM NaCl)； M Buffer (50 mM)； L Buffer (0 mM) 反应温度：大多数为37 反应时间：通常为1h或更多 终止酶切的方法： 10 mM EDTA；加热失活；苯酚抽提除去蛋白质,星星活性 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。

9、 引起星星活性的原因 甘油浓度高（5%） 酶过量（100 U/l ） 离子强度低（25 mM） pH值过高（8.0 ） 加了有机溶剂，如乙醇等 降低星星活性的措施 减少甘油浓度；减少酶用量；中性pH；提高盐浓度；反应体系中无有机溶剂；保证使用Mg2+作为2价阳离子,六、酶切位点的引入,将产生的5突出末端补平后，再连接可产生新的酶切位点 同尾末端的连接 平末端连接,第二节 甲基化酶,甲基化酶 (methylase) 的概念 甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。 甲基化酶与对应的限制酶识别相同的序列，在两条链上对某个碱基进行甲基化。,甲基化酶的种类 在E

10、.coli中，大多数都有3个位点特异性的DNA甲基化酶 Dam甲基化酶 可在GATC序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基 当需要在敏感位点上完全切割DNA时，可利用dam- E.coli扩增并提取DNA Dcm甲基化酶 识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C 的C5位置上引入甲基 EcoK甲基化酶 识别AAC(N)6GTGC 和 GCAC(N)6GTT 序列中A的N6位置,甲基化对限制酶切的影响 修饰酶切位点 Hinc可识别序列GTCGAC，甲基化酶 M.Taq可甲基化 TCGA中的A ，M.Taq处理DNA后，GTCGAC 将不受 Hinc切割 产生新的酶切位点 Dpn是依赖甲基化的限制

11、酶，TCGATCGA 受 M.Taq处理后形成甲基化(A)产物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即为 Dpn位点。 对基因组作图的影响,第三节 DNA聚合酶,一、大肠杆菌DNA聚合酶 二、Klenow DNA聚合酶 三、T4噬菌体DNA聚合酶 四、T7噬菌体DNA聚合酶 五、耐热DNA聚合酶 六、反转录酶 七、末端转移酶,DNA聚合酶 (DNA polymerase) 的概念 催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性。 原核细胞有3种DNA聚合酶 DNA聚合酶：催化单链或双链DNA的延长 DNA聚合酶：与低分子DNA链的延长有关 DNA聚合酶：促进DNA

12、链延长的主要酶,大肠杆菌DNA聚合酶 功能 53DNA聚合酶活性 53外切核酸酶活性 35外切核酸酶活性 用途 在没有dNTP的情况下，外切活性占主导地位； 当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性处在动态平衡中，结果使得双链DNA成为平末端。 利用53外切核酸酶活性,可用切口平移法标记DNA。,切口平移法标记DNA，制备分子杂交探针,KlenowDNA聚合酶 由E.coli DNA聚合酶经蛋白酶裂解后，除去53外切核酸酶活性的肽段后的大片段酶。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性 用途 补平DNA的3凹端 抹平DNA的3凸端 通过置换反应对DNA进行末端标记 随机引物标记,T4

13、噬菌体DNA聚合酶 从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性（200倍） 用途 35外切核酸酶活性强，且不从单链DNA模板上替换引物。在诱变反应中可提高诱变率近一倍。,T7噬菌体DNA聚合酶 来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，是由两种紧密结合的蛋白质形成的复合体。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性（1000倍） 应用 DNA聚合能力强，可用于长模板的引物延伸，在DNA测序中有优势。,耐热DNA聚合酶 指在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自嗜高温的细菌，主要用于PCR反应。 Taq DNA聚合酶 Vent D

14、NA聚合酶 PfuDNA聚合酶 PwoDNA聚合酶,反转录酶(reverse transcriptase) 即依赖于RNA的DNA聚合酶，有53合成DNA活性，但是无 35外切核酸酶活性。 禽成髓细胞瘤病毒（AMV） 包含两条多肽链，具 53DNA聚合酶活性和很强的RNaseH活性，在42能有效发挥作用。 Moloney鼠白血病病毒（M-MuLV） 单链多肽，其RNaseH活性弱，有利于合成较长的cDNA 用途：以mRNA为模板合成cDNA ；5突出DNA的补平和标记；DNA测序等。,末端转移酶(terminal transferase) 来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。 在

15、Co2+/Mg2+存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3-OH端。 作用 标记DNA的3末端 在cDNA或载体3末端加同聚尾，便于克隆。,第四节 其他分子克隆工具酶,一、依赖于DNA的RNA聚合酶 二、连接酶 三、T4多核苷酸激酶 四、碱性磷酸酶 五、核酸酶,一、依赖于DNA的RNA聚合酶,活性 即转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，并沿此DNA模板起始RNA的合成。 聚合反应时，无需引物，但需识别特异性位点。 类型 SP6噬菌体RNA聚合酶 (来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株) T4噬菌体RNA聚合酶 T7噬菌体RNA聚合酶 (来源于噬菌体感染的大肠杆菌) 应

16、用：体外合成RNA分子、表达外源基因。,二、连接酶(ligase),连接酶就是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。 连接酶的种类 T4 DNA连接酶 (16反应) 活性：催化DNA 5-P与3-OH之间形成磷酸二酯键。 反应底物：黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA连接 大肠杆菌DNA连接酶：平末端连接效率低。 Taq DNA连接酶 (4565反应) 连接双链DNA中的缺口，不能代替T4 DNA连接酶。 T4 RNA连接酶,黏性末端DNA片段的连接,三、T4 多核苷酸激酶,T4多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将ATP的-磷酸基团转移到DNA或RNA的5末端。 分子克隆中呈

17、现2种反应 将ATP的-磷酸基团转移到无磷酸的DNA5末端 在过量ATP存在的情况下，可将DNA的5-P转移给ADP，然后DNA从ATP中获得-磷酸而重新磷酸化。 应用 对缺乏5-P的DNA进行磷酸化 对DNA末端进行放射性标记（-32P-ATP）。,四、碱性磷酸酶,碱性磷酸酶是一类能催化除去DNA或RNA分子的5 磷酸，使末端转换成5 -OH的酶。 类型 牛小肠碱性磷酸酶（CIAP） 细菌碱性磷酸酶 (BAP) 虾碱性磷酸酶 (SAP) 用途 去除5-P，防止DNA片段自身连接 标记(5端)前去除DNA或RNA的5-P,如何解决质粒自身连接？,五、核酸酶,BAL31核酸酶 具有3外切核酸酶活

18、性，可从线性DNA两条链的3端迅速去除单核苷酸。 用途 从两头缩短DNA，用于构建嵌套缺失体；制作DNA限制酶切图。 S1核酸酶 一种单链核酸酶，降解单链DNA或RNA，产生带 5-P的单核苷酸或寡核苷酸双链。 用途 DNA黏性末端变为平末端，打开双链cDNA合成中产生的发夹环。,核糖核酸酶A (RNase A) 内切核酸酶，特异攻击RNA上嘧啶残基的3端。 用途 去除DNA样品中的RNA 核糖核酸酶H (RNaseH) 内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有3-OH和5-P末端的产物，不降解单链核酸、dsDNA或dsRNA. 用途 在cDNA克隆合成第二链之前去除RNA,脱氧核糖核酸酶(DNase) 来源于牛胰，为内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA. 用途 去除RNA样品中的DNA 切口平移标记时在dsDNA上产生随机切口 外切核酸酶 (exonuclease) 催化从dsDNA 3-OH