生化12DNA生物合成

1、基因信息的传递,基因：编码生物活性产物的DNA功能片段,基因三大特征： 携带遗传信息 能被复制 能突变,复制,翻译,蛋白质 （病毒）,RNA （病毒）,逆转录,转录,RNA,翻译,蛋白质,DNA,复制,中心法则（The central dogma）,DNA的生物合成 (复制) DNA Biosynthesis，Replication,第 12 章,复制(replication) 指遗传物质的传代，以亲代DNA为模板，dNTP (dATP dGTP dCTP dTTP)为原料，按碱基配对规律合成子代DNA的过程。,复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication,第一

2、节,一、半保留复制 (semi-conservative replication),子链继承母链遗传信息的几种可能方式,密度梯度实验,DNA半保留复制模型,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉(replication fork) 。,二、双向复制 (bidirectional replication),A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉

3、C. 复制接近终止点(termination, ter),三、复制的半不连续性 (semi-discontinuous replication),领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),半不连续性 复制过程中，领头链连续复制，而随从链不连续复制的现象。 冈崎片段(okazaki fragment) 不连续复制的片段,参与DNA复制的物质,模板(template) : 解开成单链的DNA母链 底物(substrate): dNTP DNA聚合酶(polymerase): 简写为 DNA-pol RNA引物(primer): 提供3-OH使dNTP聚合

4、其他的酶和蛋白质因子,一、复制的化学反应,目 录,磷酸二酯键的生成,+dN2TP,+PPi,DNA pol,聚合反应的特点：,聚合,新链的延长只可沿53方向进行。,DNA新链生成需引物和模板；,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase, DDDP) 简称：DNA-pol,活性：1. 53 聚合活性 2. 核酸外切酶活性,二、DNA聚合酶,DNA-pol 的 53聚合作用,15/62,35外切,5 3外切,5,3,内切酶(Endonuclease) （限制性内切酶）,35外切,5 3外切(Exonuclease),外切酶与内切酶作用图解,16/6

5、2,1. 原核生物的DNA聚合酶,共同点：1. 53 的聚合活性 2. 35 外切酶活性,DNA-pol,DNA-pol ,DNA-pol ,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和 修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,DNA-pol I 5 3外切酶活性的功能,切除引物，切除突变片段,17/62,DNA-pol I 35外切酶活性的功能,校读（proofread）功能,17/62,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA

6、，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依 然能存活。 它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能: 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD),DNA-po l 同时合成领头链和随从链,段,2. 真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,仅存在于线粒体DNA复制中。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,三、复制的保真性 (fidelity

7、),1. 遵守严格的碱基配对规律,2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能,DNA pol 靠其大分子结构协调非共价(氢键)与共价键(磷酸二酯键) 的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对时，嘌呤应处于反式构型。,DNA pol III 在催化磷酸二酯键形成之前完 成对碱基的选择；对反式嘌呤核苷酸的亲和 力较顺式的大。,3. DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol 的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。,解链酶类：,解螺旋酶,拓扑异构酶,单链DNA结合蛋白,四、复制中的解

8、链和DNA分子拓扑学变化,引物酶,1. 解螺旋酶 (helicase),作用：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链。,DnaA、B (rep蛋白、解螺旋酶)、C等,解螺旋酶,ATP,2. 单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA-binding protein, SSB),作用：防止单链DNA重新形成双链，防止 单链DNA被核酸酶水解。,3. 引物酶 (primase),催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶。,DNA合成需在RNA引物的基础上进行。,4. DNA拓扑异构酶 (topoisomerase, Topo),DNA正超螺旋与负超螺旋,负超螺旋,

9、正超螺旋,DNA双螺旋,拓扑异构酶,解链过程中正超螺旋的形成,解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DNA分子成负超螺旋再连接切口。,不需ATP，切割双链DNA中的一链，使DNA松弛后, 连接切口。,Topo:,Topo:,临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱，鬼臼乙叉甙等）是通过抑制Topo酶活性而杀死肿瘤细胞的。,作用机制,五、DNA连接酶 (DNA ligase),作用方式,催化DNA双链的3羟基和相邻的5磷酸基团形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。

10、,DNA连接酶,ATP,ATP,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,AMP+PPi,5,3,5,3,目 录,在复制中起最后接合缺口的作用； 在DNA修复、重组及剪接中起缝合缺口作用； 基因工程的重要工具酶之一。,功能,参与DNA复制的主要成员,主要成员,主要作用,DnaA,DnaB (解螺旋酶),SSB,DnaG (引物酶),TOPO,DNA-pol ,DNA-pol,DNA连接酶,DnaC,识别复制起始位点,解开DNA双链,运送和协同DnaB,合成RNA引物,维持已解开单链DNA的稳定,使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA复制,水解引物、填补空隙、修复作用,催化双链DNA中单链

11、缺口的连接,DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication,第三节,复制的起始 复制的延长 复制的终止,（一）复制的起始 (initiation ),需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,由特定蛋白质识别复制起始位点(ori)，在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉。,倒Y,1. DNA解链,E.coli复制起始点 oriC,E.coli复制起始点oriC跨度为245bp， 有3组串联重复序列和2对反向重复序列。,E.coli复制起

12、始点 oriC,Dna A,SSB,复制叉的形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,2. 引发体的生成,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,3. RNA引物合成,（二）复制的延长 (elongation),复制的延长指在DNA-pol 催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,3AAGACCTATT5,5TTCTGGATAA3,dATP,+,DNA pol,OH 3,3,领头链的合成,随从链的合成,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,1. 原核生物基因是环状DNA

13、，双向复制的 汇合点就是复制的终止点。,（三）复制的终止,2. 领头链上的RNA引物被RNA酶水解后， 由DNA pol I 催化，由新合成链提供 3-OH补齐。,3. 随从链上不连续性片段的连接,真核生物每个染色体是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活。 复制的起始需要DNA-pol和pol参与。还需拓扑酶和复制因子 (replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,二、真核生物的DNA生物合成,领头链,随从链,（二）复制的延长,

14、染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的 连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA 引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,5,染色体复制危机,反转录酶 (reverse transcriptase),反转录 (reverse transcription)现象,一、反转录病毒和反转录酶,又称为逆转录酶，为依赖RNA的DNA聚合酶， (RNA-dependent DNA polymerase, RDDP),反转录酶是多功能酶，有三种酶活性：,1. 反转录活性：即以RNA为模板合成DNA,2.

15、RNase活性：水解RNA:DNA中的RNA,3. DNA pol活性：以DNA为模板合成DNA,反转录病毒细胞内的逆转录过程,分子生物学研究可应用反转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经反转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,二、反转录研究的意义,反转录酶和反转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 反转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对反转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,三、端粒酶,端粒(telomere)

16、,指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构,对外: 抵御核酸酶等外界 因素的袭击,保护染色体结构和功能的完整性,染色体,对内: 染色体DNA的 末端复制问题,结构特点,由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含T、G 碱基的短序列。,端粒酶 (telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶反转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成:,作用：,填补

17、子链5 -末端引物水解后留下的空隙，防 止DNA缩短。,端粒酶催化作用的爬行模型,端粒酶催化作用的爬行模型,正常细胞：,细胞分裂,细胞分裂,衰老死亡,细胞年轻化,抗衰老,端粒、端粒酶与细胞衰老,约85%的肿瘤组织有端粒酶活性; 癌细胞在某些机制的作用下启动端粒酶表达而使染色体端粒稳定地维持在一定长度; 从而使癌细胞得以持续增殖、转移并获得永生。,端粒、端粒酶与肿瘤,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变 (mutation)。,在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤 (DNA damage)。,从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,一、突变的意义,（一）突变是进化

18、、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变 （三）突变导致死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,物理因素: 紫外线 (ultra violet, UV)、各种辐射,UV,化学因素,三、突变的分子改变类型,错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement),DNA分子上的碱基错配又称点突变 (point mutation),发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,转换,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,颠换,（一）错配,镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,（二）缺失、插入和框移突变,缺