发酵机制与发酵动力学.ppt

1、第四章 发酵机制与发酵动力学,本章的教学内容,第一节 糖嫌气性发酵产物发酵机制 第二节 柠檬酸发酵机制 第三节 氨基酸发酵机制 第四节 抗生素发酵机制 第五节 发酵动力学,第一节 糖嫌气性发酵产物发酵机制,糖酵解（glycolysis)是指葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸后，在无氧条件下继续降解并释放出能量的过程。 NADH2在此过程中将氢交给不同的有机物，形成各种不同的代谢产物。,糖酵解途径的特点,糖酵解途径广泛存在于各种细胞内，它的任何一个反应均不需要氧； 糖酵解可以分为两个阶段：准备阶段（由葡萄糖生成3-磷酸甘油醛）；第二阶段（由3碳糖生成丙酮酸）。 催化糖酵解反应的酶主要有激酶、变位酶、异

2、构酶和脱氢酶； 其它糖类作为碳源须先转化成葡萄糖或其中间代谢产物才能利用； 不同机体和不同代谢条件下，丙酮酸代谢去路不同。,1、酒精发酵机制,由葡萄糖生成乙醇的总反应式:理论转化率:,巴斯德效应A、定义: 在好气条件下,酵母发酵能力降低(或乙醇的 积累减少,或细胞内糖代谢降低)的现象。B、机制: EMP途径中磷酸果糖激酶在有氧时受TCA循环 中间代谢产物的反馈调节。 (1). 磷酸果糖激酶为变构酶, 抑制剂：ATP、柠檬酸和 其它高能化合物;激活剂: AMP和ADP。 (2). 好气条件下,进入TCA循环,产生的高柠檬酸量反 馈阻碍酶的合成,大量的ATP反馈抑制酶的活性。 (3). 6-磷酸果

3、糖积累对EMP途径进行抑制,导致葡萄糖 利用降低。,酒精发酵中副产物的生成(1).杂醇油 A.定义: 碳原子数大于2的脂肪族醇类的统称。 B.组成：正丙醇、异丁醇、异戊醇和活性戊醇等。 C.形成途径: 氨基酸氧化脱氨作用;葡萄糖直接生成。 (2).甲醇 果胶（聚半乳糖醛酸甲酯）中甲氧基被水解生成。(3).酯类 发酵过程产生的醇类和酸类经酯化生成。,2、乳酸发酵机制 同型乳酸发酵,总反应式为: 理论转化率:,异型乳酸发酵A. 6-磷酸葡萄糖酸途径,总反应式为 : C6H12O6CH3CHOHCOOH+CH3CH2OH理论转化率: (90/180)100% =50%,B. 双歧途径,总反应式为 :

4、 2C6H12O62CH3CHOHCOOH+3CH3COOH理论转化率: (290)/(2180)100% = 50%,3 、甘油发酵机制,A. 亚硫酸盐法甘油发酵（酵母第二型发酵）,B. 碱法甘油发酵(酵母第三型发酵),第二节 柠檬酸发酵机制,柠檬酸发酵属于好氧发酵，其发酵机制是在了解了三羧酸循环的基础上才逐渐弄清楚的。,1.柠檬酸生物合成途径,葡萄糖生成柠檬酸的总反应式为: 2C6H12O6+3O2 2C6H8O7+4H2O 理论转化率为106.7%2. 柠檬酸生物合成的代谢调节(1).糖酵解及丙酮酸代谢的调节 磷酸果糖激酶(PFK)是调节酶,柠檬酸和ATP对该酶抑制, AMP 、Pi和N

5、H4+对酶激活; NH4+在细胞内浓度升高,解除胞内积累的大量柠檬酸对酶的抑制;,柠檬酸合成有关酶的调节性质,结论: Mn2+缺乏使蛋白质和核酸合成受阻,导致细胞内NH4+水平升高而减少柠檬酸对PFK的抑制，促进了EMP途径的畅通。,(2).CO2固定化反应 丙酮酸+CO2 +ATP 丙酮酸羧化酶 草酰乙酸+ADP+Pi 磷酸烯醇丙酮酸+CO2 +ADP+Pi 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 草酰乙酸+ ATP 结论1: 在组成型的丙酮酸羧化酶作用下,丙酮酸固定化CO2生成草酰乙酸,保证柠檬酸的积累。 结论2: 丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA ,和CO2 固定两个反应平衡,保持了柠檬酸合成能力。,(3)

6、.三羧酸循环的调节 结论: 在三羧酸循环的发酵过程中,阻断顺乌头酸酶水合酶和异柠檬酸脱氢酶的催化反应, 建立一种平衡关系，大量积累柠檬酸: 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸 = 90：3：7 A.络合剂(亚铁氰化钾)除去Fe2+,顺乌头酸水合酶的活性被抑制。 B.柠檬酸的积累使pH值下降,在低pH值下,顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活,更有利于柠檬酸的积累并排出体外。,第三节、 氨基酸发酵机制,(一)、氨基酸发酵的机制和代谢控制 1、氨基酸发酵机制主要包括：谷氨酸族(谷、瓜、鸟、精氨酸等)、天冬氨酸族(赖、苏、蛋等)、芳香族(苯丙、酪、色氨酸等)、分枝链(亮、异亮、缬氨酸等)。 2、氨基酸发酵代谢

7、控制的一般措施： A、控制发酵的环境条件； B、控制细胞渗透性； C、控制旁路代谢； D、消除终产物的反馈调节作用 E、降低反馈作用物的浓度； F、促进ATP的积累(二)、谷氨酸发酵机制 1.谷氨酸生物合成途径： EMP途径、HMP途径、TCA循环、DCA循环、CO2固定作用,2. 谷氨酸生物合成途径的控制(1).三羧酸循环的调节 通过驯育谷氨酸高产菌控制三羧酸循环下列酶的活性: A. -酮戊二酸脱氢酶应丧失或仅有微弱的活力。 B.CO2固定反应的酶系强,使四碳二羧酸全部是由CO2固定 反应提供,而不走乙醛酸循环,以提高对糖的利用率。 C.谷氨酸脱氢酶的活力很强,并丧失谷氨酸对谷氨酸脱 氢酶的

8、反馈抑制和反馈阻遏。,(2).氨的导入和控制 氨的导入主要方式: 糖代谢中间体还原氨基化;天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移；谷氨酸合成酶途径。 谷氨酸发酵受NH4+的影响。使用生物素缺乏菌,在NH4+存在时,葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸; 当NH4+不存在时,糖的消耗速度很慢,生成物是 -酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。,NADP为辅酶的异柠檬酸脱氢酶和NADPH+H+为辅酶的 谷氨酸脱氢酶形成共轭反应, NADP浓度是实际上的 限速因子,添加氧化还原电位与NADP相似的氧化还 原染料,并通以电流可促进还原氨基化作用,增加谷 氨酸产量。,(3).控制细胞渗透性 A、控制生物素、油酸浓

9、度或添加表面活性剂如吐温80、阳离子表面活性剂。引起细胞膜的脂肪酸成分的改变,尤其是改变油酸含量,从而改变细胞膜通透性； B、加入青霉素或控制Mn+、Zn+浓度。抑制细胞壁的合成,由于细胞膜失去细胞壁的保护,细胞膜受到物理损伤,从而使渗透性增强。 C、生产中菌种选育模型与控制方法: 生物素缺陷型; 油酸缺陷型; 甘油缺陷型等。,(4).控制发酵的工艺条件 谷氨酸发酵是人工控制发酵条件成功进行大规模生产的典型例子。 主要的影响因子有：溶解氧、NH4+、pH、磷酸生物素、醇类和NH4Cl。,第四节 抗生素发酵机制1、抗生素的生物合成类型 A. 蛋白质衍生物 简单的氨基酸衍生物：环丝氨酸、重氮丝氨酸

10、等； 寡肽抗生素：青霉素、头孢菌素等； 多肽类抗生素：多粘菌素、杆菌肽等； 多肽大环内脂抗生素：放线菌素等； 含嘌呤和嘧啶碱基的抗生素：曲古霉素、嘌呤霉素等,B.糖类衍生物 糖苷类抗生素：链霉素、卡那霉素等； 与大环内脂连接的糖甙抗生素：红霉素、碳霉素等； 其他糖甙抗生素：新生霉素等。 C.以乙酸为单位的衍生物 乙酸衍生物的抗生素：四环类抗菌素、灰黄霉素等； 丙酸衍生物的抗生素：红霉素等； 多烯和多炔类抗生素：制霉素、曲古霉素等。,2 、青霉素、头孢菌素的生物合成机制 青霉素、头孢菌素的化学结构如下：,3、链霉素的生物合成机制 链霉素的化学结构如下：,4、抗生素生物合成的代谢调节方式(1)、细

11、胞生长期到抗生素产生期的过渡 次级代谢产物是在菌体生长到达相对静止期才产生。在细胞生长阶段,负责次级代谢产物合成的酶受到阻遏。 A.诱导因子在生长期末积累或从外源加入; B.初级代谢的终点产物耗尽; C.易被利用的糖源分解代谢物被利用后,便解除了阻遏作用; D.高能化合物ATP形成减少后，阻遏作用也就解除; E.在生长期，RNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用；当生长停 止后,酶的结构改变,允许RNA聚合酶启动生产期基因的转录作用, 负责抗生素合成的酶开始生成。,(2) 酶的诱导作用 在抗生素合成期,参与次级代谢的有些酶是诱导酶。需要底物或底物的结构类似物(外源和内源诱导剂)。,(3) 分解

12、代谢产物的调节控制 碳、氮分解代谢产物(如葡萄糖)阻遏和抑制作用,抑制抗生素合成。解除分解产物阻遏的方法: A.选育对葡萄糖代谢产物类似物抗性突变型; B.培养过程中利用缓慢的碳源,连续流加葡萄糖; C.使用含有慢慢向培养基内渗透营养物质的颗粒。,（4）磷酸盐的调节 抗生素只有在磷酸盐含量控制在生长的“亚适量”时才能合成。 磷酸盐抑制抗生素合成的机制可能有以下二方面： A.抑制或阻遏抗生素生物合成途径中有关酶的活力和合成。 B.改变代谢途径。 C.磷酸盐可调节细胞内ATP的形成。,(5) 次级代谢产物的自身反馈调节 在多种次级代谢产物的发酵中都发现了末端产物的反馈调节作用。 产生菌抗生素的生产

13、能力与自身抑制所需抗生素浓度呈正相关性。因此要选育生产能力强的抗反馈调节的突变菌株。,(6) 初级代谢产物的调节 某些初级代谢产物可以调节次级代谢产物的合成的原因: A.有一条共同的合成途径,当初级代谢产物积累时,反馈抑制了某一步反应的进行,而最终抑制了次级代谢产物的合成。 B.初级代谢产物直接参与次级代谢产物的生物合成,反馈抑制了它自身的合成时,必然也同时影响了次级代谢产物的合成。,(7) 细胞膜透性的调节 细胞膜的运输影响胞内合成及代谢物分泌和发酵产物收获。 在青霉素发酵中,生产菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。,(8) 次级代谢的能荷调节 A.能荷调节机制对次级代谢途

14、径的控制是有效的。 B.金霉菌菌株的ATP含量在生长期中迅速增加,而在金霉素形成期ATP含量迅速下降,并保持在较低的水平上。低产菌株的ATP量始终比高产茵株大24倍。 C.高浓度的磷酸盐可增加细胞内ATP的形成。,第五节 发酵反应动力学,反应动力学：研究反应速度变化规律的学科。 发酵动力学：研究各种发酵过程变量在活细胞的作用下变化的规律，以及各种发酵条件对这些变量变化速度的影响。并以数学，工程学的原理，定量描述。,目的,通过动力学研究，优化发酵的工艺条件及调控方式；（研究各种物理，化学因素的影响，为调控提供依据） 建立反应过程的动力学模型来模拟最适当的工艺流程和工艺参数，预测反应的趋势； 控制

15、发酵过程，甚至用计算机来进行控制。,发酵动力学研究内容,发酵动力学是以化学热力学（研究反应方向）和化学动力学（研究反应速度）为基础，对发酵过程的物质变化进行描述,具体内容,1. 微生物生长，死亡动力学； 2. 基质消耗动力学； 3. 氧消耗动力学； 4. CO2生成动力学； 5. 产物合成和降解动力学； 6. 代谢热生成动力学。,研究方法,宏观处理法 结构动力学模型（通过研究微观反应机制建立） 非结构动力学模型（不考虑微观反应机制，只考虑宏观变量之间的关系） 质量平衡法（根据质量守恒定律） 物质在系统中的积累速度=物质进入系统速度+物质在系统中生成的速度-物质在系统中排除的速度-物质在系统中消

16、耗的速度,菌体生长速度为,氧和底物利用速度为,P、C和HV生成速度为:,速 度,一、发酵过程的速度,比速率,细胞生长的比速率为：,底物消耗的比速率为qs,产物形成的比速率为qp：,比速率,氧消耗的比速率为qo：,二氧化碳生成的比速率 为qc：,发酵热生成的比速率：,二、化学计量学(stoichiometry),1、化学计量方程,表示通用化了的碳源,根据元素分析得出的细胞组成,表示产物,2、产率系数(yield coefficients),(1)宏观产率系数 宏观产率系数(或称得率系数)Yi/j是化学计量学中一种非常重要的参数，常用于对碳源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，其中i表示菌体或产物

17、，j表示底物 例如，菌体对底物的产率系数可表示为：,生物反应过程中宏观产率系数的定义总览,有时，以摩尔为单位表示产率系数更有利：,相似的概念可用于表达重要的常数： 摩尔产率系数在实践中对推导元素平衡方程很重要，对与氧化磷酸化有关的理论问题也有重要意义,(2)理论代谢产物产率,假设发酵过程中完全没有菌体生成，则YP/S可达理论最高值，称为理论代谢产物产率 （a）根据化学计量关系计算 例如，由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化学计量方程为 依此计算 =147/180=0.82 此处没有考虑反应过程中NADH及ATP等辅助底物的生成和消耗,（b）由生物化学计量关系计算,根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径

18、，进行代谢过程中有关NAD(P)+和ATP等辅底物的物料衡算，结合化学计量关系可求出上式： 由该反应式得 =(14713)/(12180)=0.75 此处-酮戊二酸的氨基化还原反应中所需要的NADPH由异柠檬酸脱氢反应供给，用生化计量式时, 必须清楚有关的代谢途径,(3) 实际发酵过程中的产率系数,在实际发酵中，产率是变化的，产率取决于下列因素： Y= f (菌株、底物、m、；t、tm、OTR、C/N，P/O) 式中m为混合度，S为底物浓度，t为平均滞留时间，tm为混合时间，OTR为氧传递速度，C/N为碳氮比，P/O为磷氧比,另外，Papoutsakis和Lim(1981)用碳流分支的概念来解

19、释菌体产率变化的原因：,其中r1和r分别为碳源分支代谢途径1和途径2的反应速度，MX和MS为菌体和底物的分子量，x是SX反应的化学计量系数，可见产率只随r或r变化 在甲基营养菌中存在两种不同的碳代谢流：同化(r2)和氧化(r1) 碳源和其它营养物的浓度或温度、pH等培养条件的任何变化都可能引起r或r变化 这一概念表明，甲基营养菌菌体产率的变化是一个动力学问题，而不是生物合成问题,3、化学计量的数学模型(Stoichiometric Mathematical models ),细胞培养系统非常复杂，在过程中有许多的输入和输出。而且和化学反应不同的是，在过程中，催化剂本身是在不断繁殖的； 相比较而

20、言，化学反应过程则要简单得多。,一级反应(first order chemical reaction)动力学数学模型,一级反应的方程式,底物消耗动力学,产物生产动力学方程,由（2）推导底物浓度随时间变化的模型,由（5）推导产物浓度随底物浓度变化的模型,P2 = n (S1 - S2) + P1,三、分批发酵动力学(kinetics of batch fermentation),X is the concentration of biomass in the bioreactor. Biomass concentrations are typically expressed in g/l of

21、Dry weight.,细胞生长动力学模型, is the specific growth rate.,By splitting the variables in equation (1), we obtain:,If at time t0, the biomass concentration in the bioreactor is represented by X0 and at time t1 the biomass concentration is represented by X1, equation (2) becomes:,Since is constant during the

22、 exponential phase:,Integrating both sides gives:,Finally:,无抑制作用的细胞生长动力学Monod方程,Monod发现细菌的比生长速率与单一限制性基质(growth limiting nutrient )之间存在着一定模式关系（饱和双曲线函数），创建了生化工程中著名的Monod方程（1942年）。,温度和pH恒定时，对于某一特定培养基组分的浓度s，Monod方程为 式中: max称为最大比生长速率(h-1)，Ks称为半饱和常数(g/L) 底物消耗速率方程对应为,Monod方程(Monod model ),KS，微生物对底物的半饱和常数,与

23、亲和力成反比。 当= 1/2max，S=KS 当S KS，基质浓度很低时， dX/dt = X 提高 S，可明显提高，一级反应。,Monod方程,当S KS，基质浓度较高时， 与S无关，零级反应。 当S 时， = max max是理论上最大的生长潜力。,Monod方程,Monod方程,S crit 临界底物浓度，比生长速率达到最大比生长速率 max时的最低底物浓度。 对于任一营养物质 S S crit，为非限制性底物 S S crit，为限制性底物,S crit,Monod方程,Monod方程,Monod方程中单一限制性底物可以是培养基中任何一种与微生物生长有关的营养物，只要该基质相对贫乏，就

24、成为限制性生长因子。实际过程中，可能出现多种限制性基质和抑制性物质，影响了Monod方程的适用性。,Monod方程,Monod方程应满足 (1)菌体生长为均衡型非结构生长; (2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物； (3)菌体产率系数恒定。,Monod方程与米氏方程的区别与联系 Monod方程是对实验现象的总结 是经验方程（empirical model） 米氏方程是根据酶反应极力推导得出 是机理方程（mechanistic model ） Monod方程与米氏方程的相似性。,Monod方程,Monod方程,Monod方程参数(Monod model parameters )的确定： 双倒

25、数法，线性回归，求得max和KS 以1/S对1/ 作图，为一直线 斜率=KS/ max，纵轴截距为1/ max,Monod方程,Monod方程式 中max与KS的图解求法,Monod方程,或者 以S对S/ 作图，为一直线 斜率K=1/ max，纵轴截距为C=KS/ max,计算举例,在一定培养条件下，培养大肠杆菌，测得实验数据如下表。求：该条件下，大肠杆菌的最大比生长速率m，半饱和常数Ks。,先计算S/ ,做S/ -S图,C=90,K=0.95,由K=1/ m， C=KS/ m 得： m =1.05h-1 KS =0.095g/L,用S/ 与S的数据做线性回归，得回归方程： S/ =95.14

26、+0.926S 线性相关系数r=0.9960 由该回归方程计算得： m =1.08h-1 KS =0.103g/L,（二）产物合成动力学,产物的合成（指除细胞以外的产品），特别是次级代谢产物的生物合成是一个非常复杂的过程，目前大多数研究只限于以宏观过程变量描述的模型，应用上有一定的局限性。,Gaden根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关系，将产物形成区分为三种类型 类型也称为偶联模型（醇类、葡萄糖酸、乳酸） 类型也称部分偶联模型（柠檬酸、氨基酸） 类型也称为非偶联模型（抗生素、酶、维生素、多糖）,产物合成动力学,上述三种类型外还有一种模型是qP与负偶联的模型，例如黑曲霉生产黑色素，其qP与的

27、关系可表示为： 当考虑到产物可能存在分解时： 式中，kd为产物分解常数,产物合成动力学,产物合成动力学,以产物生产率作为菌体生长率和菌体量的函数（Luedeking和Piret模型） k1 与菌体生长率关联的产物合成常数 k2 与菌体生长关联的产物合成常数,产物合成动力学,按k1,k2常数分， k10, k2=0， 生长偶联型 k10, k20， 部分生长偶联型，混合型 k1=0, k20， 非生长偶联型,产物合成动力学,产物合成动力学,生长关联型： 当k1=YP/X，k2=0， dP/dt= YP/XdX/dt， QP= YP/X 非生长关联型： 当k1 = 0， k2=QP， dP/dt=

28、QPX,k1,k2的确定： 以对QP作图 QP= k1+k2 QP，产物比生产率,产物合成动力学,（三）基质消耗动力学,基质包括细胞生长与代谢所需的各种营养成分，其消耗分为三个方面： 细胞生长，合成新细胞； 细胞维持生命所消耗能量的需求； 合成代谢产物。,基质消耗动力学,基质比消耗率QS=-dS/Xdt 产物比生产率QP=dP/Xdt,基质消耗动力学,维持系数m： 单位质量菌体在单位时间内因维持代谢消耗的基质量。是微生物的一种特性。 得率系数Y: 两种物质得失之间的计量比。 生长得率： YX/S=-dX/dS 或 X/S 产物得率： YP/S=-dP/dS 或 P/S,基质消耗动力学,维持系数

29、m和得率系数YX/S，YP/S的确定： QP为常数的情况 某些非生长偶联型产物发酵中，若控制得当，QP可保持稳定（如恒化器中）。 以对QS作图，为一直线， 斜率为1/ YX/S, 纵轴截距MS=mS+ QP/YP/S 作为广义的维持常数。,基质消耗动力学,基质消耗动力学,b. QP为变数的情况 多数情况下， QP随发酵条件，特别是比生长速率的变化而变化；利用恒化器在不同稀释率D下可得到稳定状态下的多组QS，和Qp的观测值，利用一个多元线性回归，由回归系数可得到所需的参数值。,（四）分批发酵过程的生产率,体积生产率是以每升发酵液每小时产生的产物克数表示的，是对发酵过程总成果的一种衡量。 对于分批

30、发酵过程，有必要计算总运转时间内的生产率。 总运转时间不仅包括发酵周期，也包括从前一批放罐、洗罐和消毒新培养基所需的时间。这一段时间的间隔可以少到6个小时（酵母生产），多到20小时左右（抗生素生产）。 在分批发酵过程中，产物的生成速率如图所示。,分批发酵过程的生产率,总的生成率可用自发酵过程的起点到终点的直线斜率表示，最高生产率由通过原点与单产曲线相切的直线的斜率表示，切点位置的细胞产物浓度比终点（最大值）低。,发酵过程总的运转周期：,式中tT，tD和tL分别为放罐所需时间（包括放罐，洗罐和检修）、进罐时间（包括打料，灭菌）和生长停滞期；X0和Xt是起始和终了的细胞浓度。,总的生产率,由此式可

31、以求出发酵操作过程的变化对总生产率的影响。较大的种子量将增加X0，从而缩短发酵的过程，减少放罐、检修、打料、灭菌时间，同样可缩短总周期。使用生长活力强的种子可缩短生长停滞期。例如，在发酵周期短（18-48小时）的面包酵母或谷氨酸的生产过程中，放罐和检修时间对总的生产率影响较大；对于长周期（160-200小时）的抗生素发酵过程来说，几小时的发酵罐准备时间的差别对总的生产率的影响不大。,分批发酵过程的生产率,四、连续发酵动力学,按种类（设备）分： 活塞流反应器 反应物不断沿轴向流过，若在反应器的横截面上各点的轴向流速都相等，则称此类反应器为活塞流反应器。这是一类理想的反应器，实际上反应器都与这类反应器有所偏离。在一般情况下，活塞流反应器的生产能力高于其他流动型式反应器的生产能力。 活塞流轴向不存在任何形式的混合,全混流反应器 物料进入反应器的瞬间即与反应器内原有的物料完全混合，反应器内物料的组成和温度处处相等，且等于反应器出口处物料的组成和温度。全混流反应器中，物料可能在进入反应器的瞬间即离开反应器，也可能长时间停留，因而有很宽的物料停留时间分布。搅拌良好且流体粘度不大时，连续搅拌釜式反应器的流动状况十分接近全混流模型。,全混流