课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,专题 2微生物的培养与应用,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨和二氧化碳之后才能被植物利用。,2、细菌能利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 (计数),一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例： PCR技术,启示：寻找目的菌种时要根据它对生

2、存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等； 方法： 抑制大多数微生物的生长 促进目的菌株的生长 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,3、土壤中分解尿素的

3、细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？ 从功能上属于哪类培养基？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,选择培养基,尿素是培养基中的唯一氮源， 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源，才能生长。 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5、该培养基选择分解尿素的微生物的原理,允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基,尿素,尿素,6、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为 唯一氮源 的培养基,牛肉膏

4、蛋白胨 培养基,是,分离能分解尿素的 细菌,判断该 培养基 有无选 择性,只生长能分解尿素的细菌,生长多种微生物,是,栏目链接,用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( ) A未接种的选择培养基 B未接种的牛肉膏蛋白胨培养基 C接种了的牛肉膏蛋白胨培养基 D接种了的选择培养基,C,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点：,2.间接计数法（活菌计数法） 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基

5、上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,看课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板） 第二位同学：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。(即设置重复组求平均数

6、) 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,微生物的计数法,显微镜直接计数、 间接计数法（活菌计数法）、 比浊法、 滤膜法,计算公式：,每克样品中的菌株数 =（CV）M,某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得 平板上菌落数的平均数为234，那么每克样 品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液 的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,B,（三）设置对照,判断培养基中是否有杂菌污染：,将未接种的培养基同时进行培养。,判断选择培养基是否具有筛选作用：,完全培养基（营养成分齐全）接种后培养 观察菌落数目。,主要目的是排除实验组中非测试因素对实验

7、 结果的影响，提高实验结果的可信度。,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因： 土样不同 培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案二：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案一：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的

8、配制有问题。,将细菌放在固体培养基上培养，它会繁殖并形成菌落(如下图)。某实验小组想检验两种抗生素的杀菌作用，下列哪个实验方案最合适( ),C,菌落计数,系列稀释,涂布平板与培养,配制土壤溶液,根据图示27填写以下实验流程：,实验设计：,（一）土壤取样,（二）制备培养基,（三）土壤样品的稀释,（四）取样涂布,（五）微生物的培养与观察,（八）鉴定,（七）细菌的计数,二.实验的操作流程,实验设计,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,一土壤取样,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,取土样用的小铁铲和

9、盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,二制备培养基,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管 。 将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌

10、落数在30300之间、适于计数的平板,（三）样品的稀释,问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。 结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀

11、释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,同种微生物有稳定的菌落特征：形状，大小，隆起程度，颜色,操作提示,一无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞

12、好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品 的稀释度等。 三规划时间,三、,（一）培养物(即培养的目的菌种)中是否有杂菌污染? 以及选择培养基是否筛选出菌落?,对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,四.结果分析与评价,如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。,（二）样品的稀释操作是否成功,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作

13、比较成功，并能够进行菌落的计数。,（三）重复组的结果是否一致,鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存 1、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性 2、伊红美蓝培养基：鉴定大肠杆菌 原理：代谢产物与伊红美蓝结合 菌落呈黑色并带有金属光泽。,属鉴别培养基，它并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长,五.课外延伸,伊红美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。,例如：鉴

14、别大肠杆菌培养基,大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,接种,不接种,接种,接种,需将未接种的选择培养基同时进行培养,需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目、进行对比得出结,实验设计原则 (1)设立重复组： 统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布三个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。 (2)设立两种对照组：,栏目链接,四.结果分析与评价,2,2,本课题知识小结:,课本问题答案对正,课题成果评价 （一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌

15、污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。 （二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 （三）重复组的结果是否一致 如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。,（一）旁栏思考题 1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？ 答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。 2.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 答：这是因为土壤中各类微生