课题3　分解纤维素的微生物的分离.pptx

1、课题3 分解纤维素的微生物的分离,纤维素： 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物,纤维素能被土壤中微生物分解利用，这是因为他们能够产生纤维素酶,讨论：食草动物是怎样消化食物中纤维素的？,在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素。,纤维素生物燃料： 最有希望替代石油的能源,科学家正致力于研究，怎样将农业废弃物，木材及生长更为迅速的草本植物，转化为种类繁多的生物燃料（甚至是航空燃料）,一、基础知识,1.纤维素,纤维素是以一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质,2.纤维素酶,纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包括三组分

2、，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶,（一）纤维素和纤维素酶,取二支20mL的试管,实验：纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲 乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在 140r/min的摇床上振荡1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？,本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。,实验分析：P27-2

3、8的小实验是如何构成对照的？,刚果红染色法,刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。,（二）纤维素分解菌的筛选,当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,（二）纤维素分解菌的筛选,1.方法：,刚果红染色法,该方法通过颜色反应直接筛选,2.原理：,刚果红可以与纤维素形成_,当纤维素被_分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的_,可以通过_来筛选纤维

4、素分解菌。,红色复合物,纤维素酶,透明圈,是否产生透明圈,空白的刚果红培养基,纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明带,从功能上看，这是一种什么培养基？,鉴别培养基,刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 研究人员在刚果红培养基平板上,筛到了几株有透明降解圈的菌落(见下图)。 图中降解圈大小与纤维素酶的 有关。 图中降解纤维素能力最强的菌株是 (填图中序号)。,【典型例题】,量与活性,有透明降解菌说明纤维素被纤维素酶催化降解，则降解圈大小与纤维素酶的量与活性有关。降解圈越大，说明降解纤维素能力最强。,【方法点拨】,请你根据实验流程图和提供的三个资

5、料以及“操作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。,二、实 验 设 计,分布环境,1、土壤取样：,富含纤维素的环境中,操作步骤,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,原因,实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。,讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,2、选择培养,增加纤

6、维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,目的：,制备选择培养基：,操作：,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。,14,1、纤维素分解菌选择培养基属于_（固体、液体）培养基，原因是_,【资料二】选择培养,阅读资料二“选择培养基”，回答以下几问题：,液体,没有添加琼脂,2、该培养基对微生物_（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是 _,具有,以纤维素粉为唯一碳源，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖；,15,若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将_改为_。,3、你能否

7、设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？,葡萄糖,纤维素粉,提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。,说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。,在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,将细菌涂布在只有 尿素做氮源的选择

8、 培养基上,将细菌涂布在只有 纤维素粉做碳源的 选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101107倍。,3.梯度稀释,4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养 基上,（1）制备鉴别培养基:,（2）涂布平板： 将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂

9、布到平板培养基上，30倒置培养。,鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),方法一：先 ，再加入刚果红进行颜色反应。 方法二：在 就加入刚果红。,培养微生物,倒平板前,5.刚果红染色法,挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。,这两种方法各有哪些优点与不足？,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐 刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈 2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,在细菌分解尿素的化学反应 中，细菌合成的脲酶将尿素 分解成了氨，氨会使培养基 的碱性增强，pH升高。在培 养基中加入酚红指示剂，如 果

10、pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成 红色复合物，当纤维素被 纤维素酶催化分解后红色 复合物无法形成，培养基 上就会出现以纤维素分解 菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的 环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现 透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下

11、大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！,在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C 370C培养，可获得纯化培养。,6、纯化培养,四、结果分析与评价,1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。 2.分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,【典型例题】,某些农作物秸秆富含纤维素，纤维

12、素经过水解可以形成葡萄糖，葡萄糖再经过发酵可以生产酒精。如图是利用农作物秸秆生产酒精的大致流程，请回答下列问题：,农作物秸秆含有丰富的纤维素，纤维素可以经过纤维素分解菌分解成葡萄糖。人们常常从土壤中分离纤维素分解菌。筛选纤维素分解菌常用的方法是_。其实验流程是：土壤取样选择培养_将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生_的菌落。,刚果红染色法,梯度稀释,透明圈,【课堂练习】,植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列相关问题： (1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分形成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将_分解成_ (2)为从富含纤维素分解菌的土壤中分离获得纤维素分

13、解菌的单菌落并加以鉴定，某同学设计了甲、乙两种培养基：注：“”表示“有”，“”表示“无”。 据表判断，培养基甲_(填“能”或“不能”)用于分离纤维素分解菌，原因是_；培养基乙_(填“能”或“不能”)用于鉴定纤维素分解菌，原因是_。,纤维二糖,葡萄糖,不能,液体培养基不能分离单菌落,不能,培养基中没有纤维素,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法 后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课堂总结,下列不属于微生物的是 ( ) A蓝藻和蘑菇 B葫芦藓和铁线蕨 C噬菌体和黄曲霉 D放线菌和变形虫 【答案】B,微生物营养物质,有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ） A是碳源的物质不可能同时是氮源 B凡碳源都提供能量