生化药物质量标准中的生物检定及其进展.ppt

1、生化药物质量标准中的生物检定及其进展,中国药品生物制品检定所 李湛军,生物检定（bioassay ）,一些生化药物质量标准中有生物活性测定 安全性检查 （多组分生化药的原材料来源于人、动物的组织或者体液，或者通过发酵而来。其组分不明确、按照化学药品的质控方式很难控制其质量 ） 多组分生化药注射剂基本技术要求： 涉及到多组分生化药特性的指标应订入质量标准 ，如过敏物质、降压物质、异常毒性等。活性测定也是反映产品质量的重要指标，有时比含量测定更具专属性，建议将活性测定收入标准,生物检定（bioassay ）,按生物体分类：体内测定 (in vivo)-整体动物 体外测定(in vitro)-离体器

2、官、 组织，微生物、酶和细胞 （原代细胞、传代细胞）,中国药典2005版二部中的生物检定,用于生物活性测定的生化药物有21品种 （约占我国生化药的10% ） 安全性检查-很多生化药物 （无菌、微生物限度、热原、细菌内毒素、异常毒性、降压物质、过敏等）,生物检定针对的品种-多组分生化药,对无适当理化方法检定、常规化学测定方法较难建立，不能控制其质量的药品 生物检定是反映产品质量的重要指标，具有专属性 当前英国、美国及中国药典都有收载,生物检定的重要作用,新药研发初始阶段(体外测定筛选有效成分、整体动物试验确认药效) 生产阶段：评价产品批与批之间稳定性和 一致性 生产工艺验证 （生物检定可监测不曾

3、预料、不易发现的 构象变化，它是所有变化的综合效应）,生产工艺验证的品种,DNA重组人生长激素、人胰岛素、人胰高血糖素 ，降钙素等常规检定已用理化测定 （HPLC） 药典（BP、ChP）规定：在研发阶段，生产过程中的产品必须用体内生物测定方法测定其生物效价，直到生产稳定为止,活性测定分类,活性测定-定量：质量标准中生物效价 测定（HCG、HMG、肝素） -半定量 -定性,活性测定-半定量,半定量-当理化测定占主导地位，生物效价测定降为辅助作用，只用于活性检查，设定限值，采用半定量方法，不需精确的生物统计，尽可能减少实验动物用量 如治疗二型糖尿病新药重组人胰高血糖素类多肽-1（7-36）质量标准

4、中采用半定量方法（限值为小鼠血糖降低应大于20%）进行活性检查,活性测定-定性,定性（鉴别 Identity）对质量控制能用理化测定的产品，生物测定从主导地位的定量测定降为次要的鉴别项的定性测定，只用较少的动物 例如USP29版：缩宫素（oxytocin）子宫收缩法用于鉴别；升压素（Vasopressin）大鼠血压升高法用于鉴别，效价测定均采用HPLC法 ChP2005版二部缩宫素仍用定量生物测定法,生化药标准中的体内生物检定（1）,生化药标准中的体内生物检定（2）,生化药标准中的体外生物检定（1）离体动物器官、细胞培养、生化酶促反应、免疫学活性等测定法,生化药标准中的体外生物检定（2）离体动

5、物器官、细胞培养、生化酶促反应、免疫学活性等测定法,基因重组技术产品体外生物检定多采用相对快速重复性好的细胞培养测定法，收载 ChP 2005,实验设计与生物统计,生物测定（无论体内、体外 ）的实验误差比理化测定要大 控制实验误差尤为重要 试验控制（良好实验操作、试验材料一致性） 合理的实验设计 运用生物统计,例如肝素含片质量标准 （9th册地标升国标）,内为低分子肝素:LMWH，对FXa效价测定采用体外酶促反应的分光光度法 实验设计为标准曲线法 对其相关系数（r）和每一浓度重复次数均未作要求 本实验室增加要求r 0.98和每一浓度至少重复2次 对同一批号肝素含片产品测定其抗FXa效价，结果误

6、差仍大，重现性差，波动大，缺乏可比性,改为量反应平行线原理的44实验设计并结合生物统计,要求实验可靠性测验通过： 直线回归 P0.05 P 结果较平稳，误差小，重现性好 肝素含片内LMWH不是化学纯品，是一定分子量范围内的多相性成分的分布，其相对分子量、糖链长度、硫酸化数目和位置、结构的不均一性对显色反应的分光光度法均有一定误差,正确的实验设计并运用生物统计提高实验的准确度和精密度,标准曲线法与量反应平行线44法测定同一批肝素含片产品抗FXa效价比较,生物检定进展,科技发展，一些生化药已由现代生物技术 （DNA重组、生物合成等 ）获得 检测技术、结构分析水平的提高 产品纯度 生产工艺的成熟、完

7、善，产品达到高纯 生物测定 繁琐、实验周期长、准确度差、误差大、耗费大量人力、物力 随着对动物保护、对实验动物减少、替代、优化（3R）的呼声越来越高，生物测定已不适应现代科学技术的发展,发展趋势,减少实验动物用量、降低实验费用 缩短实验周期，提高实验准确度、精密度和稳定性 检测方法的in vitro代替in vivo 简单代替繁琐 生物测定正从主导地位的定量测定降为辅助作用的半定量、定性测定，直至被取代,胰岛素（动物胰腺提取）生物检定,USP29版胰岛素生物鉴别试验( Bioidentity test) 半定量的8只家兔血糖法（SH、SL，TH、TL组，每组2只），生物效价不得低于15 USP

8、 U/mg 定量的生物效价测定需用24只家兔血糖法（ SH、SL，TH、TL组，每组6只） 定量法用于胰岛素标准品标定、新制剂稳定性的考察、胰岛素类似物特异性活性的测定，而不用于常规检定 BP2007版胰岛素采用HPLC法 ChP2005版二部，动物胰腺提取的胰岛素定量生物测定,中国药典2010年版二部生化药品专业科研项目,1、药品中氨基酸分析方法的研究（归纳分类）。（中检所负责） 2、蛋白质含量测定方法的规范化研究，增订附录。（上海所负责） 3、人工肠液和胃液中所用酶试剂的标准化研究。（中检所和北京所负责） 4、缩宫素、降钙素等品种用HPLC法替代生物测定法的研究。（各品种起草单位）。 5、

9、等电聚焦电泳法的规范化研究，增订附录（中检所负责） 6、体外生物活性测定法标准化研究。（中检所负责） 7、多合成肽（8、14、28、3、4、9肽）的相关物、不相关物的分析。（中 检所负责） 8、硫酸软骨素、香菇多糖、低分子肝素等多糖类药物的分子量及分布的标准物质的研究。（中检所） 9、多烯酸乙酯的相关物、不相关物的分析。（北京所） 10、氨基酸原料药中其他氨基酸检查方法的考察。（河南所牵头，中检所复核，各品种起草单位参加）,中国药典2010年版二部生化药品专业科研项目,11、降压物质（组胺、类组胺）质谱检测与动物实验相关性的研究。（中检所负责，上海所、广州所、天津所参与） 12、应用PCR对人

10、源性药品原材料残留病毒核酸的研究。（中山大学负责） 13、生化药注射剂、滴眼剂的可见异物检查研究。（北京所牵头，各品种起草单位参加） 14、生化药品过敏原的研究。（中检所负责） 15、辅酶A HPLC法与效价测定法的相关验证。（河南所负责） 16、磷测定方法的方法学研究。（上海所负责） 17、多酶片的质量标准提高。（陕西所负责） 18、复方氨基酸注射液等输液中铝元素考察及检查方法的建立。（辽宁所牵头） 19、修订分子排阻色谱法中生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法（增订普适校正法和宽分布标样法）。（中检所）,在本实验室已用理化测定代替生物测定两种方法间具有良好相关性（P0.01）的品种,

11、在本实验室已用理化测定代替生物测定两种方法间具有良好相关性（P0.01）的品种,发展方向,取代 在今后药品质量标准中生物测定逐渐被先进的理化方法、或能保证临床用药安全有效的其它方法所取代，或只存在于生产研究阶段 WHO国际药典及药品专家委员会第42次专家会议 (2007年10月 )讨论对于胰岛素、缩宫素等由原来生物测定转化为理化测定的提议,安全性检查（safety test）,一般原则： 注射液为肌内注射：异常毒性、过敏反应物质等检查项。原料和工艺易污染热原且用量较大者应考虑设热原检查项 注射液为静脉注射必需设异常毒性、热原(细菌内毒素) 、过敏反应物质检查、降压反应物质检查、溶血与凝聚检查等

12、所有安全性检查项 多组分生化药注射剂基本技术要求 : 由于原材料为生物来源，成品中含有各种生化物质，为保证注射给药的安全，一般须进行过敏物质、降压物质、异常毒性等检查,药典会：生化药品注射剂标准提高专项工作生化药名 考虑增订的项目,生化药名 考虑增订的项目,生化药名 考虑增订的项目,生化药名 考虑增订的项目,生化药名 考虑增订的项目,考虑增订的项目：考查有关物质 渗透压,注射用、三磷酸腺苷二钠注射液 更昔洛韦氯化钠注射液 盐酸精氨酸注射液 利巴韦林氯化钠注射液 谷氨酸钾注射液 小儿复方氨基酸注射液（18AA-） 注射用、细胞色素C注射液 小儿复方氨基酸注射液（19AA-） 注射用尿促性素 右旋

13、糖酐20、40、70氯化钠注射液 注射用绒促性素 右旋糖酐20、40、70葡萄糖注射液 注射用玻璃酸酶 注射用尿激酶 注射用门冬酰胺酶 甲硫氨酸维B1注射液,异常毒性(abnormal toxicity),定义异常毒性是检查药品在生产制造、制剂过程中外来引入的异物或药物降解产生的不正常毒性反应, 与生产工艺水平有关, 而不是检查药物本身毒性。 限值异常毒性限值剂量的设置一般在低于药物最低致死量（LD5），在药物本身的安全剂量范围内 问题：限值定的过大，（ LD50） 概念混淆，国大多数生化药注射用或注射液标准中都有异常毒性检查 , 有些品种易忽略不是考察药品本身毒性这一特性 , 应予以纠正。,

14、ChP2005中概念混淆的品种,例如右旋糖酐铁注射液 异常毒性检查: 每只小鼠静脉注射5mg (Fe) , 5 日内死亡数10 只中不得过3 只; 这实际上是考察药品本身(游离铁有毒) 的毒性, 而不应称为异常毒性。 BP2007 称该项为不当毒性(undue toxicity ) USP29 称该项为急毒(Acute toxicity ),中、英两国药典异常毒性检查法比较,给药途径、静脉给药速度,静脉注射速度 iv过快, 小鼠心脏压力骤增, 也是造成死亡原因之一，因此应缓慢注射 给药途径 异常毒性检查针对多为注射用或注射液 一般动物试验给药途径应与临床给药途径 因此不应设定口服给药途径 皮下

15、注射给药吸收速度慢、差异较静脉注射大 即使临床为非注射给药, 也应iv,以便更易于发现毒物的混入; iv给药线性关系好、斜率大是较常用的给药途径。,药典中异常毒性检查法仅ChP和BP有收载,BP2007异常毒性检查 4个生化药：抑肽酶、抑肽酶浓缩液、盐酸鱼精蛋白、硫酸鱼精蛋白 7个抗菌素品种作该项检查 其余30多品种为抗血清、疫苗等生物制品 ChP 2005版二部已有42个品种（组份和杂质明确）删除了异常毒性 但目前我国大多数生化药物注射用或注射液标准中都有异常毒性检查,USP29 安全(Safety) 检查 急毒(Acute toxicity ),USP29版安全(Safety) 检查和急毒

16、(Acute toxicity ) 与异常毒性大致相同，限度稍宽（允许 1-2只死亡） 安全(Safety) 检查 收载3个生化药：右旋糖酐40、右旋糖酐70、HMG （HMG：5只小鼠18-22g，iv 1.0ml,观察48h, 1-2只死亡，10只重试） 其余10 多种为疫苗、生物技术产品等生物制品 急毒(Acute toxicity )收载2个生化药HCG 和右旋糖酐铁（ HCG :5只小鼠18-22g，iv 0.5ml,观察48h, 1-2只有毒性症状或死亡，10只重试）,有关异常毒性检查的争议,国外文献认为它缺乏专属性和科学性，当初是在没有实施GMP的情况下，为以防万一而设 其结果各

17、实验室间差异极大，与产品质量、添加物、所用动物都毫无关联，不足以反映产品质量，不易与药品本身引起的毒性反应相区别 对动物福利、3R、现在已实施GMP等因素的考虑 微量杂质或毒物的混入，已可用理化分析方法定量测定 欧洲各国药厂和检验部门检查异常毒性从未不合格, 因此重点应放在考察生产过程, 尤其新建厂对每一生产步骤监控直到正常生产 结论：不应再在终产品质量标准中设定异常毒性检查项，异常毒性检查应当取消,我国大多数生化药物注射用或注射液标准中都有异常毒性检查,国情不同，虽然实施GMP但仍有漏洞 （由于我国生化药物多为多组分来源复杂和工艺过程的变化使生化药注射剂有可能污染剧毒物质和成分, 从而引起急

18、性毒性反应，因此, 目前对生化药注射剂设异常毒性检查项目是必要的，以后真正实施GMP ，才可考虑取消） 药典会有关高风险品种（多组分生化药 ）注射剂质量标准提高，增加安全性检查项目 某些生化药物过去没有该项的反而增加异常毒性检查,降压物质（depressor substances）,我国一些脏器提取生化药物静脉注射剂进行该检查 定义 降压物质检查是确定供试品对麻醉猫能否引起血压下降及与组胺对照品比较其下降程度 ChP和BP收载降压物质检查 BP2007附录有降压物质检查和组胺检查法 具体品种都没有 ChP过去减少，ChP2005版二部已有30个品种删除 （组份和杂质明确）,降压物质检查存在的问题,猫给药途径 静脉推注，使组织胺样物质产生急性 降压 而临床给药为静脉滴注或肌肉注射 猫的来源 复杂、个体差异大，致使有的产品 降压物质检查与临床应用不符 如复方氨基酸注射液降压物质检查不合格，而临床应用未见织胺样物质产生急性降压或类似过敏反应,降压物质检查存在的问题,猫的给药剂量 降压物质检查猫的剂量设定只能小，不能高于人临床给药剂量（无论按kg体重比还是按体表面积比折算） 猫剂量过小，不足以考察药的安全性，但当增加猫的给药剂量时则不合格，而临床应用药却是安全的 （能大于临床剂量一定