第三章食品微生物检验的试剂及配制.ppt

1、,第三章食品微生物检验的常用试剂及配制,了解染色的基本原理。 掌握常用染料的性质及其染色的配制技术。 熟悉常用试剂、缓冲溶液、物质的量浓度的配制技术。 了解培养基的种类及一些常见培养基的用途，掌握一般培养基的配制技术。,第一节 染料及染液配制技术,一、染色原理 微生物染色的基本原理，是借助物理和化学 因素的作用而进行的。 物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。 化学因素：正负离子之间的相互吸引等。,二、染料的种类,染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型： 1. 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑、苦味酸等。 2. 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿

2、、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。 3. 中性（复合）染料：如伊红美兰等，瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等（常用于细胞核染色）。 4. 单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudanb)的染料,染色细菌标本检查法 染料,细菌染色用的染料 酸性染料（阴离子染料）：染色离子带阴电荷，能与带阳电的物质结合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电时，就可用酸性染料染色。（伊红、刚果红） 碱性染料（阳离子染料）：与带负电的物质结合，细菌一般带负电，所以细菌染色所用的染料，常用碱性染料（碱性复红、美蓝）。 复

3、合染料：碱性染料与酸性染料的结合物（伊红美蓝、伊红天青）。 单纯染料：不能与被染物生成盐类,碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。 酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。 中性染料是前两者的结合物又称复合染料如伊红美蓝、伊红天青等。,三、常用染液的配制,1. 常用染料的溶解度 表3-1 2. 常用染料的配制,第二节 常用试剂的配制

4、技术,一、缓冲液的配制技术,二、物质的量浓度溶液的配制技术,1.溶液浓度表示法 2.物质的量浓度溶液的配制方法 3.溶液 浓度的调整 4.常用酸碱的物质的量浓度计算,三、pH指示剂的配制技术,四、血清学反应试剂制备技术,血清学实验在第五章讲解,五、生化试剂制备技术及试验法,什么是微生物生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。 由于细菌各自酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌。,细菌的生化反应检查法,1. 在培养物中加入某种底

5、物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的pH值变化。 2. 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。 3. 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 4. 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。,生化试验的注意事项,1.待检菌应是新鲜培养物。培养18-24h。 2.待检菌应是纯种培养物。 3.遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。 4.应做必要的对照试验。 5.提高阳性检出率，至少挑取2-3个待检的疑似菌落分别进行试验。,生化试验分类 （一）糖（醇）类代谢试验 （二）氨基酸和蛋白质代谢试验 （三）有机酸盐和铵盐代谢试验 （四）酶类试验,（一）糖

6、（醇）类代谢试验,1.糖醇类发酵试验 2.V-P试验 3.甲基红（Methyl Red）试验 MR,1. 糖醇类发酵试验,原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解12种糖醇 ，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。,糖发酵试验原理,不同微生物发酵糖的能力各异，产生的分解产物也不同，可以作为细菌分类鉴定的手段。,大肠埃希菌/产气肠杆菌,葡萄糖,CH3COCOOH,HCOOH,甲酸解氢酶,H2,+,CO2,伤寒沙门菌,葡萄糖,CH3COCOOH,HCOOH,指示剂：溴麝香草酚蓝pH7.2(蓝),举例,常用的

7、糖醇,单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇,2）试验方法,(1)试剂：糖发酵培养基中，常用的指示剂主要有 酚红、溴麝香草酚蓝 颜色反应较敏感，但稳定性较差。 溴甲酚紫和酸性复红 比较稳定，特别是对发酵迟缓的细菌，培养时间较长，宜选则二者。 (2)培养基：液体糖发酵管，半固体糖发酵管，固体糖发酵管，双糖(或三糖)高层斜面发酵管。,2）试验操作方法,以无菌操作的方法将经分离培养的纯种细菌用接种针或环移取，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置361.0 置温箱内培养经一定

8、时间(数小时至二周)培养，然后每天观察结果。,1.糖发酵试验要注意杜氏小管的置入方法； 2.在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。,注意事项,杜氏小管灌装,灌装不好会使杜氏小管中有气泡，影响观察结果。 首先将试管中装满培养液，然后用医用注射器吸取一定量培养液，排空其中空气，将针头伸到杜氏小管底部(防止气泡产生)，缓缓将培养液推入杜氏小管直到凸起(表面张力作用)，再至过量以至培养液润湿杜氏小管外表，因培养液具有一定粘滞力，它可使湿润的杜氏小管贴着试管放入时慢慢滑到试管底部，而不撞破试管底部。,气泡,导管,气泡,阳性,阳性,阴性,培养基变为黄色,培养基未变色、无气泡产生,结果记

9、录： 产酸不产气，阳性，以“+”表示 产酸产气，阳性，以“”表示 不产酸产气，阴性，以“-”表示,2.V-P试验（乙酰甲基甲醇 试验）,1）原理：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。,V.P. 试验(伏普试验),用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。,某些细菌在糖代谢过程中，经糖酵解途径产生丙酮酸。 因不同细菌所含酶不同，进一步对丙酮酸的代谢也不同。,大肠埃希菌,产气肠杆菌,VP试验阴性。,VP试

10、验（V）实验原理,举例,应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律。,2）V.P.试验,取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，1号接种大肠杆菌，2号接产气杆菌，第3支接未知菌。 37培养 48h后，加入40%KOH 510滴，然后再加入等量的5%-萘酚溶液，用力振荡，再放入37温箱中保温30min，以加快反应速度。 观察培养基的颜色变化。,3）结果观察与记录 （1）发酵管出现红色者，为阳性， 记V-P+ （2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P-,注意事项,VP实验一定要注意开盖振荡

11、！且反应时间较长。,中文名称： 大肠埃希菌,菌株保藏编号： CVCC 3038 特征特性： 非抗酸性 化能异养 最适温度37.pH7.27.4 不利用柠檬酸盐 可发酵多种碳水化合物如：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇 接触酶阳性、氧化酶阴性、脲酶阴性.MR试验阳性、VP试验阴性 属名： Escherichia 种名加词： coli,3.甲基红（MR）试验,1）原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸

12、脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。,检测不同细菌分解葡萄糖产酸的能力。,大肠埃希菌,葡萄糖,产气肠杆菌,指示剂：,分解,甲基红pH5.4(橘黄色)。,甲基红试验实验原理,pH4.5,pH5.4,举例,2）试验方法：,挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 或30 （以30 较好）培养35天，从第48h起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂12滴，立即观察结果。,3）结果观察与记录,（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR+； （2）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR-，从发现阴性并培养至第5天仍为阴性，

13、即可判定结果。,MR-VP试验原理及照片,V-P,1.靛基质（吲哚）试验 2.H2S试验 3.尿素酶试验,（二）氨基酸和蛋白质代谢试验,1.吲哚试验 （靛基质试验）,1）原理：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。,史上最快最全的网络文档批量下载、上传、处理，尽在：,40,吲哚试验,色氨酸分解反应： 吲哚反应：,不同微生物所含酶系统不同，某些细菌含有色氨酸酶，能够分解培养基内蛋白胨中的色氨酸。,大肠埃希菌,色氨酸,产气肠杆菌,色氨酸酶,+H2O,检测：,玫瑰吲哚,+H2O,玫瑰红色,吲哚试验阳性+,吲

14、哚试验实验原理,吲哚阴性 -,举例,2）试验方法：,取3支胰蛋白水培养基培养基，1号接种大肠杆菌，2号接种产气杆菌，第3支接未知菌。 37培养24h48h。 沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。 3）结果观察与记录 呈现玫瑰红色,为阳性反应,记+ 无红色者,为阴性反应,记-,靛基质试验原理及照片,靛基质+,2.硫化氢产生试验,1）原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成H2S， H2S可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。,2）方法与结果 (1)琼脂穿刺法： 培养基：三糖铁培养基、含硫酸亚铁(或醋酸铅)的半固体培养基。 操作：将试验细菌以接种针

15、沿管壁穿刺接种到含醋酸铅或硫酸亚铁培养基中，经37 24-48h培养后，观察结果。 结果：培养基变黑色为阳性。当产生硫化氢量少时，为了便于观察结果，在穿刺接种培养时，一定要沿培养基管壁进行。 (2)醋酸铅试纸法： 培养基：含胱氨酸的半固体培养基、浸有醋酸铅的滤纸条。 操作：待检菌穿刺接种培养基，悬挂醋酸铅纸条，37培养24-48h。 结果：试纸呈黑色为阳性。该法较敏感。,3）结果观察与记录,培养基底部呈黑色，为阳性，记+ 培养基底部无黑色，为阴性，记-,3. 尿素分解试验 尿素酶（Urease）试验,1）原理：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，使培养基中的酚

16、红指示剂呈粉红色。培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。,1）未接种 2）尿素酶阳性 3）尿素酶阴性,2）试验方法：,挑取大量培养1824h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。,尿素酶试验图,阳性,3）结果观察与记录 培养基呈粉红色，为阳性，记 + 培养基颜色不变，为阴性，记 -,（三） 呼吸酶类试验,氧化酶试验 过氧化氢酶试验 硝酸盐还原试验 氰化钾试验,1. 氧化酶试验,1）原理: 氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲

17、基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。,氧化酶或称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。作氧化酶试验时，此酶首先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。 本实验肠杆菌科阴性，弧菌科，非发酵菌阳性（个别除外），奈瑟菌属均阳性。 试验方法 取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深； 再加-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。,用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性。此外，也用于假单胞菌属与肠杆菌科细菌的区别，前者阳性，而后者

18、阴性。莫拉菌属、产碱杆菌属等均为阳性。 异常结果： 奈瑟菌属有脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等9种致病菌，引起流行性脑脊髓膜炎 上呼吸道症状：鼻咽炎等全身感染症状：高热、出血点或瘀血点，脑膜炎症状：头痛、呕吐、颈项强直;引起淋病，引起新生儿淋病性眼结膜炎。,氧化酶试验注意事项： 试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。 10g/L盐酸四甲基对苯二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。,试剂,1%盐酸二甲基对苯二胺 1% -萘酚-乙醇液,蓝色为+,不变色或为粉红色为-,2. 过氧化氢酶试验,1）原

19、理： 某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。,2）试验方法,用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂1-2滴在培养物上,再加入1% -萘酚-乙醇液1-2滴, 在30秒内判定试验结果。 3）结果观察与记录 在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记 + 不变色或为粉红色者,为阴性,记 -,2）试验方法,取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。,3）结果观察与记录,产生气泡者，为阳性，记+ 不产生气泡者，为阴性，记-,3.硝酸盐还原试验,1）原理：某些细菌具

20、有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应。,试剂,A、对氨基苯磺酸试剂 B、-萘胺试剂,2）试验方法,取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在361 培养14天，每天取2mL培养液,加入A、B试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。,3）结果观察与记录,呈现红色，为阳性，记+ 若无红色出现，为阴性，记-,4. 氰化钾试验,1）原理： 氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存

21、在时仍能生长,以此鉴别细菌.,2）试验方法,取培养2024h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，361 培养24 48h，观察结果。,3）结果观察与记录,对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。 对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记-。,（四）毒性酶类试验,溶血试验 血浆凝固酶试验,1. 溶血试验,1）原理： 某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。,2）试验方法,平板法 试管法,平板法,将培养物接种于血平板培养基上，361 培养24 48h，观察结果。,溶血试验的溶血类型及

22、现象,（1） （甲型）溶血: 菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。 （2） （乙型）溶血: 菌落周围出现较宽的透明溶血环。 （3）（丙型）溶血: 菌落周围无溶血环。,甲型（-）溶血,乙型（-）溶血,丙型（-）溶血, （乙型）溶血,试管法,将待检菌培养液与等量的2%羊血球混合，在361 培养16 18h，观察结果。如溶血，培养液可出现透明状。,3）结果观察与记录,有溶血现象，为阳性，记+； 无溶血现象，为阴性，记 -,2. 血浆凝固酶试验,1）原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而

23、使抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。,2）试验方法,（1）玻片法： 取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5 min内,如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为阳性;如两者呈均匀混浊，无凝固则为阴性。,有凝块,均匀混浊,血浆,生理盐水,血浆凝固酶试验,（2）试管法,取灭菌小试管3支，各加入血浆无菌水(1:1) 0.5ml，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml；其余2支作对照管，1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9氯化钠溶0.5ml作空白对照

24、。将3管同时放37温箱或水浴中培养，每0.5 h观察一次， 4 h 内无凝固现象者，观察直至24小时。,阳性反应,阴性反应,不凝固,少量、零散凝固,明显的块状凝固,巨大块凝固,完全凝固，倒置不流动,金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验,3）试管法的结果观察与记录,空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固。 试验管血浆凝固者为阳性； 均无凝固则为阴性。,其他,柠檬酸盐利用试验,1.有机酸盐的利用试验,枸橼酸盐利用试验,1）原理： 某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。,肠杆菌科各

25、种细菌利用柠檬酸盐的能力不同，有的菌可利用柠檬酸钠作为碳源，有的则不能。,大肠埃希菌,产气肠杆菌,大肠埃希菌不能利用柠檬酸盐，故不能在以柠檬酸盐为唯一碳源的培养基上生长。柠檬酸盐利用试验阴性。,产气肠杆菌能在以柠檬酸盐为唯一碳源的培养基上生长，并分解柠檬酸盐产生CO2，再生成碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，培养基中的指示剂BTB由绿色变为蓝色。,枸橼酸盐利用试验（C）实验原理,举例,2）试验方法,挑取待检菌，在西蒙柠檬酸盐培养基斜面上密集划线接种，在361 培养14天，每天观察结果。,3）结果观察与记录,斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+； 无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色

26、者，为阴性，记-,柠檬酸盐试验原理及斜面照片,阳性+,2.三糖铁（TSI）试验,1）三糖铁试验的原理,如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。 如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。,制好的培养基,对照管,斜面红色，底面黄色,培养基全黄色,斜面、底部黄色，并产生H2S,斜面红色，底部黄色，产生H2S,底面黄色，并产生CO2,2）试验方法,以接种针挑取

27、待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置361培养1824h，观察结果。,已知大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌原理？,2志贺氏菌3沙门氏菌4大肠杆菌,下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？,2志贺氏菌3沙门氏菌4大肠杆菌,思考题,提问： 志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。在培养基上应该产生什么现象？ 大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。在培养基上应该是什么现象？ 沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气，在培养基上应该是什么现象？,第三节 培养基,培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖

28、或产生代谢产物的混合养料。 要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水,微生物的六大营养素,一、培养基的成分与分类,细胞的组成成分 提供细胞代谢的介质 直接参与代谢过程 降低细胞内温度 维持生物大分子的 天然构象,合成含氮物质 提供能量,构成细胞物质 提供能量,构成细胞的组成成分； 作为酶的组成成分； 维持酶的活性； 调节细胞渗透压； 作为某些自养菌的能源。,1.培养基的成分,维持细菌的代谢、繁殖,2.培养基的分类 按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 按培养基

29、用途 基础培养基、选择培养基 增殖培养基、鉴别培养基,二、培养基pH的测定与调整,测定pH是培养基配制过程中的重要步骤之一，测定pH的标准温度为25士2。调节pH可用无菌的1mol/l氢氧化钠溶液或10%碳酸钠溶液、1mol/l盐酸溶液。 一般高压灭菌前培养基的pH会比最终pH调高0.2左右，灭菌后基本合适。,二、培养基pH的测定与调整,测定pH是培养基配制过程中的重要步骤之一，测定pH的标准温度为25士2。调节pH可用无菌的1mol/l氢氧化钠溶液或10%碳酸钠溶液、1mol/l盐酸溶液。 当调节缓冲液的pH时，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氢氧化钾溶液。 一般高压灭菌前培养基的pH会

30、比最终pH调高0.2左右，灭菌后基本合适。因此对培养基、缓冲液、试剂在灭菌前后的pH均进行测定，并记下每次pH的测定结果，有助于积累数据考察每种培养基、缓冲液、试剂对灭菌程序的耐受性，从而指导灭菌前pH的调节。 测定时，一般用指示剂滴入培养基观察其颜色的变化，或用酸度计校正，如与所需pH不符，可用以上的酸或碱液加以校正。调整pH后要加热过滤，使培养基澄清。,三、常用培养基的制备技术,1.玻璃器皿的清洗 制备培养基所用的吸管、锥形瓶、毛细吸管、平皿等玻璃仪器用前要用肥皂水洗刷后用清水冲洗干净，晾干后备用。 （1）平皿用纸或布包好，或装在金属盒内，于121高压蒸汽灭菌3min后烘干，备用。 （2）

31、试管管口用棉花塞或硅氟塑料试管塞塞好，再用布或报纸包扎好，121高压蒸汽灭菌20min后烘干，备用。 （3）吸管及滴管先用少许棉花塞于吸口端 ，然后用纸包后或装入金属吸管筒内，于121高压蒸汽灭菌20min后烘干，备用。 还可以160干热灭菌2h后，备用。,2.培养基制备的基本方法和注意事项,（1）培养基配方的选定 （2）培养基的制备记录 （3）培养基成分的称取 （4）培养基各成份的混合和溶化 （5）培养基pH的初步调正 （6）培养基的过滤澄清 （7）培养基的分装 （8）培养基的灭菌 （9）培养基的质量测试 （10）培养基的保存,培养基的分装,2.培养基制备的基本方法和注意事项,（1）培养基配

32、方的选定 同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。 （2）培养基的制备记录 每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。 （3）培养基成分的称取 培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左

33、侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。,4、培养基各成份的混合和溶化 培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢莴加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。 5、培养基p

34、H的初步调正 因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终PH，保证培养基的质量。PH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。 6、培养基的过滤澄清 液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此 ，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。 琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉

35、的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至5560C的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入12个鸡蛋的蛋白，强力振摇35分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121C加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。,7、培养基的分装 培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试管一般多有用螺旋盖者）。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基

36、时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。 8、培养基的灭菌 一般培养基可采用121C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。 某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50C左右的培养基中。 琼脂斜面培养基应在灭菌后立即

37、取出，冷至55-60时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。 9、培养基的质量测试 每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。 将全部培养基放入361C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。 用有关的标准菌株接种12管或瓶培养基，培养2448小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。 10、培养基的保存 培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签,（4）培养

38、基各成分的混合和熔化,溶化：一般应放在玻璃器皿或搪瓷齐内。加入蒸馏水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。 在使用干燥培养基时，先将蒸馏水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置1015min，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要热，必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高，避免某些营养成分被破坏。,大微DW-9型微生物试剂分液器是一款精密输送液体的电子蠕动泵分液系统，是大微科技专为微生物实验室中各种试剂溶液(培养基、缓冲液、稀释液等)的精确计量和分装而设计，它可以使您频繁的重复分液操作变得轻松、高效！配备不同直径的分液管，在得到多种分装量

39、范围的同时，保证精确的分液精度。仪器一机多用，1台设备，即可实现“倾注平板制备”和“试管分装”等多种用途；被广泛应用于各种食品、药品企业、政府检测机构和科研单位的专业微生物实验室。 3. 可简易编程，能够在设定的时间内分注预设容量的液体，同时显示分注累积容量。 4. 分装快速，1L溶液分装到100个试管中，最快仅需2分钟。,（3）培养基的分装：大批量配制时使用的自动分配器须经校准和确认。每次使用前后，均要对分配器的管道系统进行冲洗，在分装无菌培养基前，则要采用无菌硅胶管。 固体培养基一般分装在250ml、500ml锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。 平皿：倾注平皿，应在无菌室中放置3

40、4h，如用塑料平皿须在35培养箱 中倒置3060min。让水蒸汽自然蒸发。 斜面：制备低层斜面分装于试管，约占容积1/5，灭菌后趁热斜放在细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装使注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，如沾有培养基应用布抹去，以避免污染。 高层斜面：制备高层斜面分装于试管，约占试管容积的1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用。 分装好的培养基或缓冲液等及时密封后必须在配制当天（2h内最佳）进行灭菌处理。液体、半固体培养基一般在高压灭前分装，约装试管容积的1/3，在灭菌后还要加其他成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。 培养基的灭菌：培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭

41、菌，各种培养基的灭菌时间和压力，按其成分不同而定。普通培养基采用121、103.42kPa灭菌15min，但容器和装量较大时，应延长至20min。含糖培养基115、68.85kPa灭菌30min。含糖、血清、鸡蛋等培养基可用流动蒸汽及血清凝固器80100、30min，连续3d，间歇灭菌。血清或组织液，采用低热5658水浴1h，连续56d灭菌，一些遇高温即被破坏的物质如尿素、腹水等，可用细菌过滤器，过滤除菌。高压灭菌应严格按照操作规程执行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达到全部杀灭微生物。以上的灭菌时间和温度要经过验证确认，如不同类型培养基混合一起灭菌时宜

42、采用115、68.85kPa灭菌30min为好。,称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 分装：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。 灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。,2.培养基的制备,3.食品检验常用培养基的制备技术,（1）基础培养基,营养琼脂培养基 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 20g 自来水 1000mL pH 7.2

43、7.4 灭菌 12115min,用于分离和培养细菌,马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基 （用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基） 其配方如下： 去皮马铃薯（或鲜豆芽） 200g 蔗糖（或葡萄糖） 20g 自来水 1000mL 琼脂 20g pH 自然 灭菌： （含蔗糖） 1.05kg/cm2 20min （含葡萄糖）0.1kg/cm2 30min,（2）PDA培养基,（3）淀粉琼脂培养基（高氏一号） 配方如下： 可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g 琼脂 20g

44、自来水 1000mL 灭菌： 121 15min,用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。,无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材料。 100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水45.0mL，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。,无菌水的制备,棉塞的制作,培养基制备技术 -培养基分类,根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分： ）天然培养基 天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成

45、的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。 ）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。 ）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实

46、验室中使用最多。 根据培养基的物理状态来区分： ）液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。 ）固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。 ）半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.21%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。,培养基制备技术 培养基的分类,根据培养基的用途来区分： (1)通用培养基：培养异氧细菌最常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基；配制适合于厌氧菌生长的培养基时，通常须在培养基中加入适量的还原剂如巯基醋酸钠、维生素C或半胱氨酸来降低培养基的氧化还原电位，以利于厌氧菌的生长。 (2)鉴别培养基：是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌落的培养基。(伊红美蓝琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、亚硫酸铋琼脂、微生物快速显色培养基） (3)选择性培养基：根