生物制药第八章多肽与蛋白质类药物2.ppt

1、第八章 多肽与蛋白质类药物,三、干扰素,干扰素(Interferon，IFN)最早是由英国科学家Isaacs和Lindemann于1957年在研究病毒干扰现象时发现的。 1965年发现了白细胞干扰素， 1969年发现了致敏细胞干扰素。,3.1 干扰素的定义 1980年，国际干扰素命名委员会对干扰素下的定义为：干扰素是一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质。现在，一般指脊椎动物细胞受干扰素诱生剂作用后合成的一类具有细胞功能调节作用的蛋白。,3.2 分类 干扰素在整体上不是均一的分子，可根据其来源细胞不同，分为白细胞干扰素(IFN-)、类淋巴细胞干扰素(IFN-与IFN-的混合物)、成纤维细胞

2、干扰素(IFN-)、T 细胞干扰素(IFN-)等几类。 IFN型干扰素又以其结构不同再分为IFNb、IFN和IFNb等亚型。,3.3 干扰素的作用 抑制病毒等细胞内微生物的增殖； 抗细胞增殖， 通过作用于巨噬细胞、NK细胞、T淋巴细胞、H淋巴细胞而进行免疫调节； 改变细胞表面的状态，使负电荷增加，组织相容性抗原表达增加； 增加细胞对双链DNA的敏感性。,3.4 传统方法生产干扰素 传统方法生产工艺流程：利用血库血大量制备人血细胞干扰素。,工艺过程及控制要点 分离灰黄层 取新鲜血液(一般每份400ml)，加入ACD抗凝剂，离心后分离出血浆，小心吸取灰黄层。每份血可吸取1315ml，放置4冰箱中过

3、夜。, 氯化铵处理 每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，再加入9倍体积量的冷的氯化铵溶液(0.83)，混匀，4放置10min，然后在4离心(8000 r/min) 20min。 小心弃去上清液，再用9倍量的0.83氯化铵液重复处理1次，溶解残存的红细胞。 取沉淀的白细胞并悬于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温的培养液稀释成每毫升含107个活细胞。, 启动诱生 取稀释的细胞悬液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为100g/ml置37水浴搅拌培养2h。 正式诱生 启动后的白细胞加入仙台病毒(在10天龄鸡胚中培养4872h，收获尿囊液)使其最后浓度为每毫升100150血凝单位，在37搅拌培养过夜。

4、 收获 将培养物离心(2500 r/min) 30min，吸取上清液即得粗制干扰素。, 纯化 将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾0.5mol/L，用2mol/L盐酸调节pH=3.5，离心弃去上清液，得沉淀1。沉淀1加入原体积1/5量的冷乙醇(94)，离心弃沉淀得上清液1。上清液1用盐酸调节pH=5.5，离心弃去沉淀，再调至pH=5.8，离心，得上清液2和沉淀2。沉淀2加入原体积1/50量的甘氨酸-盐酸缓冲液(pH=2)溶解，检测，得IFN1。上清液2调节pH值至8.0，离心弃去清液，得沉淀3。沉淀3加入原体积1/50量的0.1mol/L PBS，0.5mol/L硫氰化钾(pH=8)溶解，pH值降

5、至5.2，离心得上清液3和沉淀4。,沉淀4加原体积l/25000量pH=8.0的0.1mol/L PBS溶解，调至pH=77.5，对PBS(pH=7.3)透析，过夜，离心，收集上清液，检测，得IFN-B。上清液3中加盐酸使pH值降至3.0，离心，得沉淀5。沉淀5加入原体积1/5000量的pH=8、0.1mol/L PBS溶解，加NaOH调节pH=77.5，对PBS(pH=7.3)透析过夜，离心收集上清液，检测，得IFN-A。每份灰黄层约能制备100万单价的纯化干扰素。,此法特点是一次纯化量大，回收率高于60；经济，简便，易于普及。效价可达1.2108 U/ml，比活2.2106 U/mg(蛋白

6、)。IFN-A中干扰素含量占回收干扰素的82，比活也比较高。IFN1的比活较低5104 U/mg (蛋白)，一般可作外用滴鼻剂或点眼剂等。,3.5 基因工程干扰素的生产 1973年Cohen将两种不同的DNA分子进行体外重组，并用大肠杆菌表达，使大量、廉价制备单组分干扰素成为可能。1980年和1982年利用基因工程成功地获得了IFN-、IFN-和IFN-的cDNA，标志着第二代干扰素的诞生。1987年，3种干扰素的生产开始工业化，并大量进入市场。,克隆及基因文库的构建 干扰素的基因文库构建一般是用诱导剂对可以产生干扰素的肿瘤细胞株进行诱导，从中取出mRNA，通过相应的引物对干扰素的mRNA进行

7、逆转录-PCR扩增，将其与一定的质粒相连接后用合适的宿主菌进行培养、扩增即可。 以从Namalva细胞中克隆IFN-、为例。,将Namalva细胞用Senda病毒诱导后从上清中用酚提取mRNA，通过oligo(dT)纤维素柱纯化及520(W/V)蔗糖密度梯度离心25000r/min 20 h后取618S的组分。用逆转录酶合成第一条互补链后用DNA聚合酶合成第二条链，用核酸酶S1切成平头末端后520(W/V)蔗糖密度梯度离心进行纯化，取大于600 bp的组分。,将0.5g平头末端cDNA用末端转移酶加15个dC，并将2g质粒pBB322在Pst位点线性化，用末端转移酶加15个dG，再将两者连接，

8、利用这种方法可产生新的Pst位点，利于从载体上再次切下cDNA。将产生的质粒转化大肠杆菌HB101后，用微量板培养。合成引物5-CCTTCTGGAACTG- 3，该序列是IFN-、最长的不间断保守序列，用其作引物可同时调出IFN-、。,在T4激酶的作用下，用-32P-ATP对其进行标记，并用Sephadex G-25进行纯化。用cDNA作为引物对其进行延长，并再用Sephadex G-50进行纯化，使可得到标记后的cDNA。,将微量板上的菌落转移到纤维素膜上，当菌落直径长到2mm后与事先分离的末端标记的cDNA 37杂交2d。然后用50甲酰胺、0.2SSC(1SSC为0.15mol/LNaCl

9、，0.015mol/L柠檬酸钠) 室温洗膜3h。在上述杂交液中加入50 g/ml poly(U)、10g/ml poly(I)poly(C)进行杂交，用50甲酰胺、1SSC洗脱后在室温干燥，并于-70曝光，检测细胞中质粒与cDNA杂交的情况。,为进一步检测转入的质粒的准确性，还要用菌落与原始诱导细胞中的DNA进行杂交。 经过以上两次杂交筛选的菌落，还要对其产物进行定性。 如产物为干扰素，则说明所建立的文库可供以后基因的调取使用。,基因文库的调用 从构建好的噬菌体文库中调用IFN基因，可以用32P标记的DNA探针与噬菌体文库进行Southern印迹，探针可以是根据IFN的编码序列人工合成的一段D

10、NA短链或其他种属的IFN外显子编码序列。由于IFN的种属特异性，因此印迹的条件不能太严格，这种方法可以用人IFN-的全部外显子从噬菌体文库中调出鼠IFN-的基因。,表达方法 鼠干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的1040位、78107位、123166位的A、B、C区，尤其是位于78和79位的氨基酸对抗病毒活性十分重要。 人IFN-1的121136位对抗病毒活性作用较大，人IFN-的N端10个氨基酸也是保持其活性所必需的。 嵌合表达的干扰素往往优于单一干扰素。,IFN-的表达 用家蚕核型多角病毒BmNPV体外感染的家蚕传代细胞株BM-N通过噬菌斑法纯化得到BmNPV的T3亚型。利用从感染脂

11、肪体mRNA制得的cDNA为探针，对其多角蛋白序列进行检验，其中10.5kb的EcoR片段及3.9kb的Hind片段可与探针杂交，将10.5kb的EcoR片段克隆到pBR322中，产生质粒pBmE36。对其用Hind 酶切，得到3.9kb片段，其中含有多角蛋白全部序列，将该片段插入pUC9的Hind位点，产生质粒p9H18。,将p9H18用EcoR切后于50U BAL 31外切核酸酶缓冲液中23水浴10min，更换缓冲液，并加入0.2倍体积的0.5mol/L EDTA终止反应。,将截短的p9H18片段用Hind 酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳分离2.7kb的Hind 平头末端片段，将其插入pUC9

12、即p9B310的Hind-Sma位点。 另外，将pBmE36的3.1kb的Hind 片段连接到pUC8上，得到质粒p8H225，用EcoR及Aat切，得含有多角蛋白基因下游3.1kb基因的3.5kb片段，将其连接列p9H18的4.7kb的EcoR-Aat片断上，产生杂交质粒p89B310，它在启动子上游含有多聚接头(EcoR、BamH、Sma、Sal、Pst位点)。,将从基因文库中用183bp探针调出的在ATG后含有Sma位点(即有序列CCCGGGATG)的IFN-J基因片段连接到p89B310上，使构建成质粒pIFN2B310。,将pIFN2B310与病毒基因组DNA便可共转染BM-N细胞系

13、或家蚕幼体，即可得到重组病毒BmIFN2B310、用两个噬菌斑单位的病毒感染3106个BM-N细胞或用50l 3105个噬菌斑单位的病毒溶液注入家蚕幼体，培养24h后收集培养液使可得到干扰素。,3.6 基因工程干扰素的生产工艺 制备基因工程-干扰素的工艺流程如下： 下面以基因工程人干扰素b为例说明其生产过程。, 发酵 a生产种子 人干扰素b基因工程菌SW-IFN-bEcoli-DH5。质粒用PL启动子，含氨苄西林抗性基因。 b种子培养基 1蛋白胨、0.5酵母提取物、0.5NaCl。 c种子摇瓶培养 在4个1000mL三角瓶中，分别装入250mL种子培养基，分别接种人干扰素b基因工程菌，30摇床

14、培养10h，作为发酵罐种子使用。,d发酵培养基 1蛋白胨、0.5酵母提取物、0.01NH4Cl、0.05NaCl，0.6Na2HPO4、0.001CaCl2、0.3KH2PO4、0.01MgSO4、0.4葡萄糖、50mg/ml氨苄西林、少量消泡剂。 e发酵 用15L发酵罐进行发酵，发酵培养基的装量为10L，pH6.8，搅拌转速500 r/min，通风比为11m3(m3min)，溶氧为50。30发酵8h，然后在42诱导23h即可完成发酵。同时每隔不同时间取2ml发酵液，在10000 r/min离心除去上清液，称菌体湿重。, 产物的提取与纯化 a提取 离心,去上清液，得湿菌体。 湿菌体重新悬浮于磷

15、酸缓冲液(pH7.0)中，于冰浴条件下进行超声破碎，离心30min，取沉淀。 室温搅拌抽提2h，离心，取上清液。 用磷酸缓冲液(pH7.0)稀释，加二硫基苏糖醇至0.1mol/L，4搅拌15h，15000 r/min离心30min，除去不溶物。,上清液经截流量为104相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素b液经过Sephadex G-50分离，层析柱(2cm100 cm)先用20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，收集人干扰素b部分，经SDS-PAGE检查。,b纯化 将Sephadex G-50柱分离的人干扰素b组分，再经DE-52柱(2cmcm)

16、纯化，人干扰素b组分上柱后用含0.05mol/L，0.1mol/L，0.15mol/L NaCl的20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)分别洗涤，收集含人干扰素b的洗脱液。全过程蛋白质回收率为2025，产品不含杂蛋白、DNA及热原质。干扰素b含量符合要求。,4、白细胞介素,4.1 白细胞介素（interleukin，IL）又称白细胞间素，简称白介素。白细胞介素是指由活化的单核-巨噬细胞及淋巴细胞等所产生的一类细胞因子，它作用于淋巴细胞、巨噬细胞或其他细胞，负责信号传递，联络白细胞群的相互作用。在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用。白细胞介素与相应细胞的结合，这种连续的细胞因子与细胞间相互作用

17、，可以扩大和调节免疫应答。,白细胞介素2(IL-2) 于1983年克隆成功。 IL-2是一种糖蛋白，含133个氨基酸；分子量为1535kD，无抗原特异性，可在经激活后的T细胞培养上清液中收集。IL-2在pH29范围内稳定，56加热1h仍具有活性，但6530min即丧失活性。在4mol/L尿素溶液中稳定，对2-巯基乙醇还原作用不敏感。对各种蛋白酶均敏感，对DNA酶和RNA酶不敏感。,在人IL-2的第58位、105位、125位是半胱氨酸(Cys)残基，其中第58位和105位的两个半胱氨酸间形成分子内二硫键，这对IL-2保持其生物活性是必不可少的。第125位的Cys呈游离态，很不稳定，在某些情况下可

18、与58位或105位的巯基形成错配的二硫键，从而使IL-2失去活性。,图5-7 人IL-2基因结构、IL-2mRNA和IL-2分子,4.2 白细胞介素的制备 IL-2的传统制备工艺 (1) 工艺流程,(2) 工艺过程及控制要点 诱生 用鸡瘟病毒和PHA联合刺激人外周血白细胞，37培养。 病毒灭活和固液分离 用6mol/L HCl调节pH2.02.5，再用6mol/L NaOH调回到pH7.27.4，离心除去变性杂蛋白。, 硫酸铵分级沉淀 取上述离心后的培养上清液，加饱和硫酸铵至35饱和度，4静置4h，离心弃去沉淀。上清液补加固体硫酸铵至85饱和度，4静置24h，离心，收集沉淀。 除盐 将沉淀溶于

19、10mmol/L PBS中(内含2正丁醇和0.15mol/L NaCl)，pH6.5。对10mmol/L PBS(pH6.5)透析24h(更换5次透析外液)。, 蓝色琼脂糖层析 将上述透析内液通过Sepharose 4B层析柱，用200ml起始PBS洗去不吸附的蛋白，再用含0.4mol/L NaCl的PBS洗涤亲和柱，最后用含1.0mol/L NaCl的PBS解吸IL-2活性组分。 凝胶层析 将解吸的IL-2活性组分经PEG(MW6000) 浓缩，再上ACA44 Ultrogel层析柱。用含0.1PEG、2正丁醇和pH7.6的0.5mol/L甘氨酸的0.2mol/L Tris-HCl洗脱，得IL-2。,2基因工程IL-2的制备 (1) IL