沙眼衣原体检测新进展

1、沙眼衣原体检测的新进展，杨会林，1，沙眼衣原体Chlamydia，细菌滤膜，特异性真核细胞内寄生，具有独特发育周期的微生物体积略大于病毒，在光学显微镜下可见，具有DNA、RNA两种核酸、核糖体和接近细胞壁的膜受二分法增值抗生素抑制，现属广义细菌范畴。 2、衣原体C. trachomatis，具有特殊的发育周期，镜检观察到2种不同的形态结构：1.原体(EB ) :存在于细胞外，具有高感染性的2 .始体(RB ) :根据细胞内衣原体的抗原结构和DNA同源性的特征， 衣原体分为衣原体(C. trachomatis )、肺炎衣原体(C.pneumoniae )、鹦鹉螺热衣原体(C.psittaci )

2、和家畜衣原体(c.psittaci ) 4种，前3种致病于人，衣原体为衣原体4，沙眼衣原体C. trachomatis，分为a、b、Ba、c、d、Da、e、f、g、h、I、Ia、j、k三种生物型，即小鼠生物型，沙眼生物型和性淋巴肉芽肿型。 后者与人类疾病有关。 5，CT抗原结构，特异性抗原：衣原体细胞壁脂多糖(LPS )识别表位位于2-酮-3-脱氧辛酸(KDO )三糖，可与肠道菌Re变异株交叉反应的种特异性抗原：主要外膜蛋白(MOMP ) )衣原体是性传染病的主要病原体。 男性主要并发非淋菌性尿道炎、睾丸炎、前列腺炎、性淋巴肉芽肿等的女性可引起尿道炎、宫颈炎、输卵管炎、骨盆炎等。 重症患者可通

3、过引起不孕和异位妊娠的性接触或非性接触方式感染新生儿、儿童，引起新生儿肺炎和新生儿包涵体的结膜炎，给预防沙眼衣原体感染带来很大困难。 沙眼衣原体(CT )感染，8 .沙眼衣原体感染，9 .沙眼衣原体感染，10 .沙眼衣原体(CT )感染，淋病天生菌混合感染多的淋病天生菌对沙眼衣原体的繁殖发挥着活性和促进作用。 衣原体感染能够提高人们获得HIV的概率。 最近，有人建议CT感染能提高患癌症的风险。 CT感染破坏p53蛋白，增加突变细胞的生存风险，最终导致癌症。 11、沙眼衣原体感染流行病学，传播途径：性接触传播、母婴垂直传播、接触沙眼患者毛巾、洁面乳和洗脸盆传播。 女性宫颈炎和男性尿道感染临床上无

4、症状，呈隐性感染，易携带，引起感染传播。 根据12，沙眼衣原体感染流行病学，根据世界卫生组织，每年有9200万新发的沙眼衣原体感染病例。 在美国，根据Datta SD等人的调查，14岁到39岁的群体中，沙眼衣原体的感染率约为4.6%； 根据欧洲、Redmond S等的大规模调查，18岁到26岁之间有性经验的群体中，沙眼衣原体的感染率约为3.6%； 根据Peters R等人的修订，在非洲的一些国家的乡村，女性衣原体的感染率达到了16%以上。13、沙眼衣原体感染流行病学、中国Li CL等2012年湖北省婚前筛查报告显示，婚前女性中3.6%感染沙眼衣原体。 根据Chen XS等人2013年针对女性劳

5、动者的研究，在女性劳动者中，衣原体的感染率高达17.3%。 据调查统计，深圳地区非淋菌性尿道炎患者中，男性患者沙眼衣原体检出率为30.57%，女性为21.19%。14 .沙眼衣原体感染防治，沙眼衣原体对阿霉素、强力霉素、喹诺酮类抗生素敏感，易于确诊后治疗。 预防沙眼衣原体感染和传播的主要难点是准确、及时地发现病原菌。15、CT标本采集及运输、标本采集：1.沙眼及包涵体结膜炎患者：擦拭脓性分泌物，用擦拭器用力擦拭结膜上蒂或下蒂，或取眼结膜刮片。 2 .泌尿生殖系感染患者：男性患者用无菌棉拭子插入尿道口，2cm旋转35秒后取出的女性患者采样宫颈移行部位。 3 .小儿肺炎患者：用刮水器在鼻咽后部或咽

6、部采集。 4 .性病肉芽肿标本：取淋巴结脓汁。 标本运输：装入2SP培养基中运输，2SP培养基含有蔗糖、磷酸盐缓冲液、胎牛血清、抗生素等成分。 标本取样后5天内检查，标本须暂时保存于4。16、沙眼衣原体检测技术、直接涂膜镜检测：包涵体细胞培养抗原检测：直接荧光抗体检测、酶免疫检测、胶体金法抗体检测核检：核酸探针检测、PCR、荧光定量PCR、PCR产物直接检测、17、包涵体检测对急性、严重新生儿包涵体性结膜炎的诊断价值很大。 泌尿生殖道内完整细胞少，细胞内包涵体脆性大，敏感性低。 19、细胞培养法，因为CT特异性细胞内寄生，可以在68天龄的鸡胚蛋黄囊及各种继代细胞中培养。 在适当条件下，将含CT

7、标本接种经放线菌酮处理的单层小鼠成纤维细胞(McCoy )或宫颈癌细胞(Hela-299 )，孵化后染色，镜下检查包涵体。 20，衣原体细胞培养法，细胞培养工序：制备致密的单层细胞。 以Hela-299细胞为例，六孔板每孔接种75万细胞，孵化24小时。 用30ug/ml DEAE-葡聚糖处理细胞30分钟，丢弃提高细胞膜内吞咽能力的DEAE-葡聚糖，交换5ml不添加血清的培养液，加入菌液。 菌液的量必须由菌液浓度决定，过高会导致细胞病变过快，提早大量死亡，过少会导致阳性率过低，观察不到或无法订正。 六孔板3000rpm 1238g离心分离。 通过物理作用促进衣原体进入细胞。 据报道，通过离心分离

8、可使感染效率提高100倍，21，在衣原体细胞培养法、孵化箱中孵化2小时，为衣原体提供进一步感染的时间，也为细胞提供恢复状态的时间。 感染液交换：细胞培养液1g/mL放线菌酮。 4872小时碘染色或Giemsa染色或Macchavello染色的观察结果。 22，衣原体细胞培养法，23，衣原体细胞培养法，特异性100%和敏感性80%。 被认为是CT检查的“金标准”分离培养操作复杂、技术要求高、所需时间长的标本敏感性受标本采集、运输、保存等影响较大的各实验室技术水平不同，标准化难度多用于科研和临床纠纷病例的最终鉴定，24，胶体金法，25，的缺点：敏感性差26、酶免疫测定(EIA )采用ELISA法，

9、采用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测CT可溶性抗原。 用脂多糖(LPS )单克隆抗体或多克隆抗体检测。 27 .酶联免疫测定(EIA )、敏感性64%、特异性93%简便。 适用于自动化。 适用于短时间内大量标本的检测，与其他微生物感染偶尔有交叉反应，如金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、a组、b组链球菌等。 28 .微量荧光免疫法抗体检查、患者血清中有无CT抗体检查。性病性淋巴肉芽肿、精巢炎、输卵管炎患者血清中的CT水平明显提高，这种方法有助于诊断。 一部分患者感染CT后，有时不发生，有时只发生少量的抗体，此时检查容易出现假阴性结果。 检测出重现性差，目前没有统一标准。 不建议单独用于CT感染诊断。 直

10、接荧光抗体测定(DFA )用荧光体标记CT单克隆或多克隆抗体(通常是抗衣原体MOMP单克隆抗体)，并与对应抗原结合进行反应，直接观察。 直接荧光抗体测定(DFA )显示，男女标本敏感性分别为70%和68%，特异性分别为87%和82%； 检查不需要快速简单培养法那样有活力的CT。 对于子宫内膜和输卵管样品，DFA法比培养法敏感性高，适合直肠样品的敏感性和特异性依赖单克隆或多克隆抗体的荧光易猝灭，结果被判断为主观和经验，不适于大量样品检测。 31、核酸杂交法、125I标记CT rDNA探针检测宫颈刮水器。 敏感性和特异性分别为细胞培养法的82.8%和99.4%。 用吖啶酯标记单链DNA探针，与标本

11、中的CT rRNA杂交，用化学发光法测定。 敏感性和特异性分别为60%和95.8% 98.8%。 32、PCR检测、DNA提取、引物及探针的设定修订、特定DNA片段的扩增1 .普通PCR :容易污染引起假阳性，不能定量检测。 2 .荧光定量PCR :全闭管放大系统，以避免污染的参照物为基准，可以定量分析拷贝数。 33，荧光定量PCR检查，34，PCR检查，特异性高，敏感性好。 荧光定量PCR无电泳交叉污染定量检查。 目前认为泌尿生殖系统中的CT感染量与患者的临床表现有关。 CT定量检测有助于临床诊断和判断疗效。 男性可以用尿标本代替传统尿道刮水器，样品收集方便，患者接受方便。 可修饰同一病原体不同DNA片段的双重PCR技术，可有效检测出某目的基因发生突变的标本。 可检测不同病原体的双重PCR，如雅普公司CT/NG试剂盒。 比传统的检测方法通量高，适合大规模的流行病学研究。 比较35、EIA、PCR、DFA三种方法可知，36、PCR产物直接测序，CT MOMP基因经PCR扩增后，测序PCR产物，完成CT的分型检测。 单血清型CT感染检查的金标准。 适用于单血清型CT感染分型检查及大规模流行病学调查。 测序方法不适用于双重或多重感染。 另一方面，CT双重或多重感染率5%、37、CT检查技术在STI流行病学研究中的应用不同地区、不同人群、C