课题2　月季的花药培养 (2)

1、课题2 月季的花药培养,知识回顾,单倍体育种的过程？,花药离体培养（N）,单倍体植株（N）,秋水仙素处理，使染色体翻倍,植株（2N）,特点：1 明显缩短育种年限,2 后代植株都为纯合子。,正常植株（2N）,一、被子植物的花粉发育,被子植物花粉的发育过程,四分体时期,单核居中期 单核靠边期,双核期,花粉母细胞 （小孢子母细胞）,4个小孢子,减数分裂,1个小 孢子,花粉粒 （双核）,有丝分裂,花粉管细胞核,营养细胞,生殖细胞核,2个精子,小孢子母细胞,（ ）时期,单核（ ）期,双核期,（ ）细胞核,（ ）细胞核,（ ）细胞,（ ）细胞,（ ）个精子,（ ）分裂,（ ）分裂,单核（ ）期,（ ）分裂

2、,减数,小孢子四分体,中,边,有丝,生殖,生殖,花粉管,营养,有丝,2,2N,N,N,N,N,N,N,N,N,1小孢子母细胞,4小孢子,花粉囊,花药,4花粉粒（双核期）,成熟花粉,8个精子,花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。,花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、双核期,（二）产生花粉植株的两种途径,移栽,体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似,这两种途径之间没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及浓度配比。,胚状体,在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常

3、相似的结构，发育过程亦与合子胚类似；,神奇的人工种子,:通过胚状体途径形成小植株,烟草花药培养,胚状体发育途径,愈伤组织转接种到再生培养基,愈伤组织分化形成再生植株,水稻花药培养,愈伤组织发育途径,部分花药产生愈伤组织,接种在平板上的水稻花药,胚状体：离体培养的某些体细胞在形态上转变为与合子 发育成的胚非常相似的结构，胚芽，胚轴，胚根等结构 完整，就像一颗种子，这种结构叫体细胞胚，或胚状体。,愈伤组织：离体的组织细胞经过细胞分裂，形成的排列 疏松无规则，高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞。,不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响。,选择合适的花粉发育

4、时期是提高诱导成功率的重要因素。,因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。,选材是否成功是花药培养成功的关键。,1、选材,三、影响花药培养的因素,一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期。,选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎； 选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药。,花药培养时期的选择,其它时期选择的缺点,为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。盛开的或略微开放的花，都不宜选

5、作实验材料。,选择完全未开放花蕾的原因,完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒,单核期花药的挑选,为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？,花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。,花药培养时间,一般月季的花药培养时间选在5月初到5月的中旬，即月季的初花期。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功率。,2、培养基的组成 （ MS培养基+不同比例的植物生长调节激素）,亲本植株的生长条件、材料的低温预处理、接种密度等对诱导成功率都有一定的影响。,3、其他因素：,（一）材料选取,从花药看：月季的初花期 从花粉看：单核期 从花蕾看：完全未开放的,四、实

6、验操作,1.我们怎样选择想要的花粉呢？,镜检 方法：醋酸洋红法(将染色体染成红色) 焙花青-铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色)。,花药（载玻片上）1%的醋酸洋红1滴用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）,花药（在卡诺氏固定液中处理20min）取出，置于载玻片上焙花青铬矾溶液染色盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）,2.我们怎样保证所选的材料处于单核期？,（一）材料选取,2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。 方法：醋酸洋红法(将染色体染成红色) 焙花青-铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色)。,1、从花药看：月季的初花期 从花粉看：单核期 从花蕾看：完全未开放的,四、实验操

7、作,（二）材料的消毒,5、无菌水冲洗35次 花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态,1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒,2、无菌水清洗,3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分,4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中24分钟 （质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）,在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药,要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。,立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花药7-10个。,1、剥取花药,勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织。,2、接种,注意：,（三）接种和培养,培养条件：温度控制在25左右，不需要光照。幼小植

8、株形成后才需要光照。,3、培养,培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。 长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。,注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。,在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是营养细胞核和生殖细胞核融合造成的）。,4、鉴定和筛选,课题成果评价,选材是否恰当 选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会 通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。,无菌技术是否过关 如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如 培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。,接种是否成功 如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状