课题3　血红蛋白的提取和分离 (3).ppt

1、课题3 血红蛋白的提取和分离,主要内容： 一、基础知识 二、实验操作,思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性、变性、空间结构,思考4 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红

2、细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,一、基础知识：, 凝胶色谱法（分配色谱法）：,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）,2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶

3、外部,较短,较快,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢,一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理,二、缓冲溶液,在一定范围内，能够抵制 对溶液PH值的影响，维持PH 不变。,1.作用:,2.配制:,通常由 溶解于水中配制而成。调节缓冲剂 的就可以制得在 使用的缓冲液。,3.提问：在本课题中使用的缓冲液是:_ , 其目的是:,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性),磷酸缓冲液,外界的酸和碱,基本,12 种缓冲剂,使用比例,不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲对。,NaH2PO4 /

4、 Na2HPO4,H2CO3 / NaHCO3,三、 电泳-血红蛋白的分离鉴定方法,1.概念：,带电粒子在 作用下发生 的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 的基团，在一定的PH下，这些基团会带上 或 。在电场的作用下，这些带电分子会向着的 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,电场,迁移,可解离,正电,负电,与其所带电荷相反,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,影响蛋白质分子运动速度的因素,最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和

5、琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,（1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 等因素。,它所带静电荷的多少以及分子的大小,（2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（ ）。,分子的大小,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,电泳检测PC

6、R结果,二、实验步骤,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,样品处理粗分离纯化纯度鉴定（电泳）,实验操作,样品处理,（一）蛋白质提取和分离步骤,红细胞的洗涤,粗分离：,血红蛋白的释放,分离血红蛋白溶液,纯化：,纯度鉴定,透析去除样品中分子量较小的杂质,用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,1. 血液有哪些成分？,二、实验操作：样品处理粗分离纯化纯度鉴定,知识回顾,2与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点? 这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义?,1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA

7、的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,血红蛋白,答:血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液.这使血红蛋白的分离过程非常直观,大大简化了实验操作.,目的：去除（ ） 方法：（ ）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（ ），将下层（ ）的红细胞液体倒入（ ）,每个肽链环绕（ ），此基团可携带（ ）。血红蛋白因含有（ ）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。,一个亚铁血红素基团,一分子氧或一分子二氧化碳,血红素,(1)红细

8、胞的洗涤,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,暗红色,烧杯,再加入用（ ）的（ ）质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤 低速离心（低速短时间）,重复4、5步骤（ ）次，直至上清液中已没有（ ），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。,五倍体积,生理盐水,三,黄色,1、样品的处理 （1）红细胞的洗涤 A、洗涤目的: B、分离时采用 离心，用 洗 涤，重复洗涤 ，直至 为什么要低速短时离心？ 防止白细胞沉淀 C、能否用蒸馏水代替生理盐水？,去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化,低速短时间,五倍体积的生理盐水,三次,上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净,不能，生理盐水能保持红

9、细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。,D、为什么要缓慢搅拌？,防止红细胞破裂释放出血红蛋白。,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,(2)血红蛋白的释放,加（ ）到（ ）体积，再加40体积的（ ）（ 溶解细胞膜） ，置于（ ）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白.,原血液,甲苯,磁力搅拌器,蒸馏水,（2）释放血红蛋白,思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？（蒸馏水，40%体积的甲苯） 为了加速释放过程，采取了什么措施？ （使用磁力搅拌器充分搅拌）,目的分析： 蒸馏水的作用是_。 加入甲苯的作用是

10、_。 充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,磁力搅拌器,搅拌器转子,搅拌器正在工作,(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:,第1层（最上层）： （ ）甲苯层,第2层（中上层）： （ ）的沉淀层， （ ）色薄层固体,第3层（中下层）： （ ）的水溶液层 （ ）的液体,第4层（最下层）： 其它杂质（ ）的沉淀层,无色透明,脂溶性物质,白,血红蛋白,红色透明,暗红色,甲苯层（无色透明）,白色薄层固体,红色透明液体,杂质沉淀层（暗红色）,试管中溶液层次,用滤纸过滤，除去脂溶性

11、沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,取( )ml的血红蛋白溶液装入（ ）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（ ）中，pH为（ ），透析12小时，,透析袋,磷酸缓冲液,7.0,(4)透析,1,2.粗分离-透析（去除分子量较小的杂质）,（1）用 方法进行粗分离，透析袋由硝酸纤维素制成，又称 。将透析袋放入 溶液中进行透析。 （2）透析的原理是 （3）透析的目的是 。,透析,玻璃纸,透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内,去除样品中分子量较小的杂质,磷酸缓冲,透析过程中如何去除无机盐离子和小分子有机物？ 半透膜的选择透过性，大分子物质不能通

12、过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH7的磷酸缓冲液中。 透析过程中为何使用pH7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？ 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。,（1）凝胶色谱柱的制作,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。,底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。,3、纯化（凝胶色谱）-去除相对分子量较大的杂质蛋白,凝胶色谱柱的制作,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 “G”表示凝胶的交联程度，膨

13、胀程度及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分

14、（ ）12小时。,洗涤平衡,注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。,50cm,教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？,如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。,思考,装配好的凝胶柱,(3）样品加入与洗脱,加样前,打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口,缓冲液,凝胶面,加透析样品,调整缓冲液面：与凝胶面平齐 滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ）的

15、样品加到色谱柱的（ ） 样品渗入凝胶床：（ ） 洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集,注意正确的加样操作： 不要触及破坏凝胶面 贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动,吸管,透析液,顶端,样品完全进凝胶层,5ml,红色的蛋白质,4、纯度鉴定（电泳）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、垂直板电泳装置 2、稳流稳压电泳仪； 3、微量进样器（可用微量移液器代替）,（5）装槽、点样：,拔出梳子 将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内） 在电泳槽中加入缓冲液 点样。,（6）电泳：,（7)、剥胶、染色及脱色 凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将

16、凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。,(8)、结果,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入

17、大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：,2.试剂的配制：,鉴定血红蛋白纯度。,1.目的：,丙烯酰胺和N, N-亚甲

18、基双丙烯酰胺: 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-亚甲基双丙烯酰胺的贮存液。十二烷基硫酸钠（SDS）: 用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。Tris甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。样品处理液： 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8

19、)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。染色液： 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。脱色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。,1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。 2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。,注意事项：,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6 mL，30

20、%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高23 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过

21、硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。,（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板,（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备：,3、电泳方法步骤,（3）样品处理：在电泳样品中按11体积比加入样品处理液，在100 温度下加热3 min，以使蛋白质变性。（4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（5）加样：按

22、顺序加样，加样量通常为1025 L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品（6）电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。（7）剥胶：从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。（8）染色：将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h。（9）脱色：染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。（10）观察结果：

23、SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。,3、电泳方法步骤,3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,判断（ ）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。,纯化,3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度,（1）试剂的配制,丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液,十二烷基硫酸钠（SDS） 用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。,用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液, TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。,用去离子

24、水配制10% 过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。,Tris甘氨酸电泳缓冲液 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。,样品处理液 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。,染色液 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸 脱色液 10%的甲醇和10%的冰醋酸。, SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备,1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板,2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制

25、备,用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高23 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。,（2）电泳方法步骤,配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。,分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。,3）样品处理,5)加样,在电泳样品中按11体积比加入样品处理液，在100 温度下加热3 min，以使蛋白质变性。,按顺序加样，加样量通常为1025 L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品,4）浓缩胶聚合完全后（30 m