课题3　血红蛋白的提取和分离 (13).ppt

1、本课题学习目标，体验从复杂系统中提取生物高分子的基本过程和方法，了解色谱、电泳法等分离生物高分子的基本原理。 1 .主要概念：凝胶色谱电泳法缓冲溶液对血红蛋白的提取分别起什么作用？ 主要原理：凝胶色谱分离蛋白质原理电泳法样品分离原理缓冲溶液的组成和作用机理，3，课题重点：凝胶色谱原理和方法4，课题难点：样品处理柱填充剂的处理和柱填充。 问：血液中有什么成分？ 1 .问题：用鸡的红血球提取DNA，用猪、牛、羊的红血球提取血红蛋白的理由是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，容易提取DNA。 人类红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，易于提取血红蛋白。 血红蛋白、各肽链包围血红素基，该基

2、可以携带氧一分子或二氧化碳一分子，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 血红蛋白的特征：1 .分离生物大分子的基本想法：用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 2 .蛋白质分离和提取原理：根据蛋白质各种特性的不同，如分子的形状和大小、带电电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和与其他分子的亲和力等，可以用于分离不同种类的蛋白质。 一、血红蛋白的提取与分离、(一)凝胶色谱(分配色谱)、2 .凝胶：很多凝胶是由多糖系化合物(例如葡聚糖或琼脂糖)构成的多孔小球体，内部有许多贯通通道。 根据被分离物质相对于蛋白质分子质量的大小，使用具有网状结构的凝胶进行分离。 1 .概念：3 .凝胶色谱

3、的原理是当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通路，路程长、移动速度慢，而相对分子量大的蛋白质则不能进入凝胶内部的通路，只能在凝胶外部移动分离出相对分子量不同的蛋白质分子。 所依据的特性是蛋白质分子量的大小。4 .用凝胶色谱分离蛋白质的原理和具体过程、用凝胶色谱分离蛋白质的过程的动画演示、(二)缓冲溶液、1 .概念：在一定范围内，少量的强酸或强碱可以抵抗的影响原溶液的PH值2、作用：3 .缓冲溶液的制备：通常通过将12种缓冲剂溶解在水中来制备。 通过调节缓冲剂的使用比例，可以得到在不同PH范围内使用的缓冲液。 4、问题：本课题使用的缓冲液为：_，其目的为：利

4、用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构与功能，易于观察(红色)。 2 .原理：许多重要的生物大分子如多肽、核酸等具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团带正电或负电。 通过电场，这些带电分子向与其带电的电荷相反的电极移动。 电泳利用分离的样品中各种分子的带电性质的差异以及分子自身的大小、形状的差异，使带电分子产生不同的移动速度，实现了样品中各种分子的分离。 3 .型号：琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳。 由于、电场，这些带电分子向与其带电的电荷相反的电极移动，琼脂糖凝胶电泳图像、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的移动度，取决于其带电的净电荷的多少和分子的大小等因素。可将SDS加到凝胶

5、中以移除净电荷(SDS的作用)对迁移率的影响。 2、原理：SDS可使蛋白质完全改性。 由几条肽链组成的蛋白质复合体经SDS解聚成单一肽链，测定结果仅为单一肽链的分子量。 SDS可以与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合体，SDS携带的负电荷量大大超过蛋白质分子本来的电荷量。 因此，可以隐藏不同种类蛋白质间的电荷差，使电泳迁移率完全依赖于分子的大小。 3、SDS作用机制：SDS测定蛋白质的分子量的方法、使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可以选择已知的一组分子量的标准蛋白质进行电泳市场上销售有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂。二、实验操作、样品处理粗分离纯度检定、1、样品处理

6、：(一)蛋白质提取和分离工序、(二)操作过程、本课题可以选择猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液分离血红蛋白。 (1)红细胞清洗：清洗目的：去除杂蛋白，有利于后续血红蛋白的分离纯化，清洗次数不得过少。 清洗操作：1，采集血液样本。 2 .低速短时间离心分离(速度越高，时间越长，白血球和淋巴球等越一起沉淀，不能得到分离的效果) 3、吸收血浆：上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤：用质量分数0.9的氯化钠溶液以5倍体积洗涤。 重复3次低速离心(低速短时间) 6、4、5的步骤，直到上清液没有黄色为止，表示清洗干净。 (2)血红蛋白的释放：将蒸馏水加入原来的血液体积，再加入40体积的甲苯，放在磁力搅拌器上充分

7、搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂释放血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液：过程：将搅拌的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10分钟。 试管中的溶液水平：第1层(最上层):甲苯层(无色透明)第2层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体)第3层(中下层):血红蛋白的水溶液层(红色透明液体)第4层(最下层):杂质沉淀层(暗红色)。 分离：用滤纸过滤，去除脂溶性沉淀层，在分液漏斗中静置一段时间后，分离下层的红色透明液体。甲苯层(无色透明)、白色薄层固体、红色透明液体、杂质沉淀层(暗红色)、试管中的溶液水平、(4)透析：过程：取1ml血红蛋白溶液放入透液袋中，进行透液的透析目的

8、：除去样品中的分子量小的杂质。 透析过程动画演示、2 .凝胶色谱操作：(1)凝胶色谱柱的制作：取长40厘米、内径1.6厘米的玻璃管，两端用砂纸磨。 底栓的制作：开孔挖出口袋，在移液管头部安装尼龙网，再用100目的尼龙丝包住，插入玻璃管的一端。 注意事项：插入底部插头的玻璃管的上部不要超过橡胶插头的凹槽底面。 尼龙网很难铺设，液体会残留，蛋白质的分离会变得不完全。 顶塞的制作：用冲头安装玻璃管。 组装：把这三个在对应的位置组装成一体。 安装其他附属构造。 (2)填充凝胶柱，凝胶选择： a，材料：交联葡聚糖凝胶(G-75 )。 b、代表性含义：“g”表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围。 75表

9、示得到的凝胶水的值，即每克凝胶膨胀时的吸水量为7.5。 凝胶预处理：配置凝胶悬浮液：将一定量的凝胶浸渍在蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，修正为制备凝胶悬浮液。 凝胶柱的装填方法： a，固定：将柱装置固定在支架上。b .充填：将凝胶悬浮液一次慢慢放入色谱柱内，充填时轻轻敲击色谱柱，使凝胶充填均匀。 注意： 1、凝胶填充时要尽量密集，减少凝胶粒子间的空隙。 2 .装填凝胶柱时不能存在气泡，因为气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱顺序，降低分离效果。 洗净平衡：装填结束后，立即用缓冲液洗出瓶子，在50cm的高操作压下，用20mmol/l的磷酸缓冲液300ml(ph7.0)平衡12小时充分洗净。 注意： 1、液

10、面不得低于凝胶表面。 否则气泡会混入，可能会影响柱内的液体流动和最终生物高分子物质的分离效果。 2 .不发生洗脱液流干燥、凝胶粒子露出的现象。 (2)凝胶柱的装填、高度50cm、(3)样品的添加和溶出、缓冲液面的调节：打开下端出口，使柱内缓冲液逐渐下降到与凝胶面齐平，关闭出口。 透析样品的滴下：吸管吸取1ml样品加到柱子的前端，在滴下样品时，吸管的喷嘴与管壁紧密接触，使样品环绕移动，同时注意不要破坏凝胶面。 样品渗透凝胶地板：放入样品打开下端出口，使样品渗透到凝胶地板内，样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：慎重加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液至适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，

11、打开下端出口洗脱。 收集：当红色蛋白质接近柱下端时，用试管收集流出液，每5ml收集试管，连续收集。 (分离过程中，如果红色区域均匀移动，则表示色谱柱的制作成功)注意：正确的取样操作： 1、不要接触凝胶面，不要破坏。 2、贴墙样品。 3 .使吸管的喷嘴沿管壁环绕移动。 (3)样品的添加和洗脱，注意：正确的取样操作是： 1、不接触凝胶面，不破坏凝胶面。 2、贴墙样品。 3 .使吸管的喷嘴沿管壁环绕移动。 考虑使血红蛋白在稳定的pH范围内，维持正常的结构和功能的问题。 1、在血红蛋白纯化的全过程中持续用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他蛋白质相比血红蛋白具有什么特征？这个特征对血红蛋白的分离有什

12、么启发？因为血红蛋白是有色蛋白，在凝胶色谱分离时这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。血红蛋白的提取和分离的过程分为四个步骤，包括样本处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 首先，通过清洗红血球、血红蛋白的放出、离心等操作收集血红蛋白溶液、即：个样本，通过处理透析除去分子量小的杂质、即样本的粗分离，然后通过凝胶色谱法除去相对分子量大的杂质蛋白质3、能说明血红蛋白分离的完整过程吗？ (三) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(选择)，2 .试剂制备：鉴定血红蛋白纯度。 1 .目的：3 .方法步骤：(略)观察你处理的血液样本在离心分离后是否分层(参照教科书图5-18 )，如果分层不明，则清洗次数少，可

13、能是不能除去血浆蛋白的原因。 另外，如果离心速度过高、时间过长，白细胞和淋巴细胞会一起沉淀，得不到纯红细胞，会影响后续血红蛋白的提取纯度。 三、实验结果的分析和评价，1、血样处理完了吗？能说明处理后的样品有什么变化吗？ 2、你填充的凝胶柱上没有产生气泡吗？ 你的柱子装填成功了吗？ 你是怎么判断的？ 如果有气泡的话会怎么样，因为凝胶是半透明的介质，所以在凝胶柱的旁边放置垂直于凝胶柱的荧光灯，可以检查凝胶是否均匀地填充。 另外，加入蓝色右旋糖酐2000和红色右旋糖酐等大分子的有色物质，也可以观察色带移动的样子。如果色带均匀、狭窄、平坦，则表示凝胶柱的性能良好。 如果色谱柱上出现条纹或气泡，轻轻敲击柱体去除气泡，无法去除时重新安装柱子。 气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱顺序，降低分离效果。凝胶柱的装填成功，分离操作也正确的话，血红蛋白的红色区域均匀地移动的红色带变形、散射、扩大的话，表示分离的效果差，这会导致凝胶柱的装填。 3、蛋白质分离过程中红色带的移动能观察到吗？请说明红色带的移动情况，并据此判断分离效果，蛋白质的提取和分离练习问题解答：1-5:bcdc a6- 103360 a