分子标记技术及其应用.ppt

1、分子标记技术及其应用,遗传标记主要有四种类型:,形态标记（morphological marker） 细胞标记（cytological markers） 生化标记（Biochemical marker） 分子标记（molecular marker）,分子标记的优越性：,直接以DNA形式出现，生物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题； 数量极多，遍及整个基因组； 多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析； 表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁； 许多标记为共显性。,1. 几种常用的分子标记技术,基于Southern杂交的分

2、子标记 基于PCR技术的分子标记,1.1 基于Southern杂交的分子标记,限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA）,1.1 基于Southern杂交的分子标记,限制性片段长度多态性， 简称RFLP 优点：稳定，是一种共显性标记，可区分纯合体与杂合体。 缺点： 分析所需DNA量较大， 步骤较多，周期长， 制备探针及检测中要用到放射性同位素,Restriction fragment length polymorphism analysis,RFLP Based on the mu

3、tations,RFLP,1.1 基于Southern杂交的分子标记,小卫星DNA又称数目可变串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeat，VNTR）是一种重复DNA小序列，为10-几百核苷酸，拷贝数10-10000不等。 缺点：多态性分布集中，合成探针困难，应用并不广泛。,Genetic fingerprinting,Parents and offspring have similar genetic fingerprints,1.2 基于PCR技术的分子标记,随机扩增片段长度多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA）

4、特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP） 简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR） 扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）,1.2 基于PCR技术的分子标记,随机扩增片段长度多态性DNA，简称RAPD技术 是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的一项遗传标记技术。RAPD一般采用10个核苷酸的DNA序列为引物，扩增时退火温度降至35左右。,RAPD标记,1.2 基于PCR技术的分子标记,RAPD的优点： 无种属特异性 适合于自

5、动化分析 不需制备探针、杂交等程序，成本较低。 DNA用量少，允许快速、简单地分离基因组DNA。,1.2 基于PCR技术的分子标记,RAPD缺点： 是一种显性标记 稳定性较差,1.2 基于PCR技术的分子标记,特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP）或称序标位（Sequence Tagged Sites，STS）包括以下两种： 酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP） 序列特异性扩增区（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR）

6、和位点特异相关引物（AlleleSpecific Associated Primers，ASAP）,CAP 标记,Indica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT Japonica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT Indica (51) TACTTGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Japonica (51) TACTAGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACA

7、GTTGATGGTG Indica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Indica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT Japonica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT,SBE1片段,Left primer,Right prim

8、er,SBE1 CAPS marker derived from 3-end was used to detect SBE1 gene in DH lines,SCAR标记,1.2 基于PCR技术的分子标记,简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）或称微卫星DNA（Microsatellite Repeat）、简单串联重复序列（Short Tandem Repeat Polymorphism，STRP）。 在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。,SSR标记,SSR检测杂交种郑

9、单958纯度 P1:父本；P2：母本； 1-22：杂交种,M P1P21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16171819202122,1.2 基于PCR技术的分子标记,扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP），又称选择性限制片段扩增（Selective Restriction Fragment Amplification）。,AFLP 标记,High percentage of polymorphic bands No prior sequence knowledge required H

10、ighly reproducible AFLP fingerprints Genome survey Saturation of target gene,SNP标记,Indica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT Japonica (1) CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCAT Indica (51) TCCATGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Japonica (51) TCCATc TTTTGTA

11、GGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTG Indica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAG Indica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT Japonica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT,SB

12、E1片段,Left primer,Right primer,G,C,A,T,PCR,变性，退火,G,C,A,T,CEL I,变性,走胶，检测,2 分子标记在育种中的应用,分子图谱的构建 品种、品系鉴定和杂交种纯度分析 亲缘关系分析 基因标记及标记辅助育种（Marker-assisted Selection，MAS） 数量性状因位点（QTL）的分子标记辅助选择,2.1 分子图谱的构建,主要包括以下步骤： 根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体； 群体中不同植株或品系的标记基因型分析； 标记间的连锁关系。,2.2品种、品系鉴定和杂种纯度分析,在国外，指纹图谱用来鉴定作物品种的DUS（D

13、istinctness，Unformity， Stability），为品种审定、保存、保护提供依据。 指纹图谱要求：分辨率高，多态性强；重复性好，稳定可靠。,The specific band in Xianyou 63 amplified with AFLP primer combination E-AAC/M-CAT,1 2 3,SSR检测杂交种郑单958纯度 P1:父本；P2：母本； 1-22：杂交种,M P1P21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16171819202122,2.3 亲缘关系分析,DNA标记所检测的是作物基因组DNA水平的差异，因而

14、非常稳定，在分子图谱帮助下对品种之间的比较可覆盖基因组，大大提高结果的可靠性。 品种资源的鉴定与保存 研究作物的起源与发展进化 指导杂交育种亲本选配，减少杂交组合数，有效划分杂种优势群，为提高育种效率提供依据。,2.4 基因标记及标记辅助育种,标记目标性状的方法： 近等基因系法（Near-isogenic Lines，NILs） 混合群体分组分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA）,2.4 基因标记及标记辅助育种,MAS的主要应用有两个方面。 有利基因的转育 有利基因累加,2.4 基因标记及标记辅助育种,标记辅助选择育种已开始在育种中应用。 Chen（2001）利用

15、与水稻抗白叶枯病基因a21连锁的标记辅助选择，通过3代回交、1代自交成功地将a21基因导入恢复系6087中，6087（a21）与轮回亲本相似性达到98.8。,2.5 数量性状因位点（QTL）的分子标记辅助选择,QTL是在高密度的遗传图谱基础上，通过一定实验设计，获得分子标记，借助Mapmarker软件分析确定控制某一性状的基因在染色体上的位置。当目标性状由少数几个基因控制时用标记选择，对发掘遗传潜力非常有效。,3 问题及其对策,显性与选择效率 基因型限制 稳定性、可操作性,3.1显性与选择效率,显性标记不能区分纯合、杂合基因型 相斥相（Repulsionphase）的RAPD标记可提高选择效率。 与菜豆普通花叶病毒抗性基因bc-3连锁相引标记-1选择纯合抗病株、杂合体、纯合感病株分别占26.3%，72.5%和1.2%，用相斥标记-2选择分别占81.8%，18.2%和0。,3.2 基因型限制,最有价值的标记是在广泛的基因背景下都能表达，并能检测出来的标记。 标记与目的基因的遗传距离是影响辅助选择效率的一个重要因素。,3.2 基因型限制,解决方法： 寻找无重组的RAPD标记或将RAPD标记转化为RFLP标记,3.3 稳定性、可操作性,RFLP操