第7章分子标记辅助育种(准).ppt

1、分子标记辅助选择育种,第一章 遗传标记概述,定义：指可以明确反映遗传多态性的生物 特征。 特点：能够稳定遗传而且遗传方式简单。 经典遗传学，多态性指等位基因的变异。 现代遗传学，多态性指基因组中任何座位 上的相对差异。,一、 遗传标记的概念,形态学标记 细胞学标记 生化标记 分子标记,二、 遗传标记的种类,(一) 形态学标记,形态标记：是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。,优点：形态标记简单直观、经济方便； 缺点: (1)数量在多数植物中是很有限的; (2)且多态性较差，表现易受环境影响， (3)有一些标记与不良性状连锁。 (4)形态标记的获得需要通

2、过诱变、分离纯合的过 程，周期较长。因此形态标记在作物遗传育种 中的作用是有限的。,(二) 细胞学标记,细胞学标记：是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。 染色体的结构特征: 染色体的核型和带型 染色体的数量特征: 整倍性和非整倍性,水稻IR36初级三体的形态特征,优点：受环境影响较小 缺点（1）标记材料的产生需要花费大量的人力、 物力进行培养选择； （2）有些物种对染色体结构和数目的变异 的耐受性差，难以获得相应标记材料； （3）标记的数目有限。,酶蛋白质和非酶蛋白质,种子贮藏蛋白,醇溶蛋白,谷蛋白,水溶蛋白,同工酶,等位酶,(三) 生化标记,isozyme,allozyme,大豆同工酶图谱

3、,优点： 蛋白质是基因表达的产物，与形态标记和细胞学标记相比，数量上更丰富，受环境影响更小。 缺点： （1）每一种同工酶标记都需要特殊的显色方法和技术； （2）某些酶的活性具有发育和组织阶段的特异性； （3）局限于反映基因组的表达信息； （4）标记的数量有限。,(四) DNA分子标记,1.概念 DNA分子标记：指以DNA遗传多态性为基础的一类遗传标记。DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，甚至是单个核苷酸的变异。,2.分子标记的特点,能稳定遗传； 多态性高、揭示的信息量大； 无表型效应； 不受环境影响； 不受组织和发育阶段的影响； 表现中性 ,第二章 DNA标记技术,RFLP (

4、restriction fragment length polymorphism，限制性内切酶酶切片段长度多态性) 标记；,第一节 基于DNA-DNA杂交的DNA标记,原理：生物在长期进化的过程中，会在种、属甚至品种间同源DNA序列的限制性内切酶识别位点上出现差异，在限制性内切酶作用下产生许多大小不等的DNA片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，与DNA探针特异结合的特定限制性酶切片段即为RFLP分子标记。,酶切位点突变,W1,M1,插入突变,W2,M2,缺失突变,W3,M3,8.0,2.5,8.0,W1,M1,W3,M3,W2,M2,8.0,10.5,1

5、.6,9.6,8.0,6.9,6.9,8.0,9.6,8.0,2.5,2.5,8.0,2.5,2.5,2.5,Probe,酶切位点,RFLP实例,total DNA,RE,electrophoresis,blotting,probe(p32),hybridization,多态性来源 RE 酶切位点的点突变 限制性酶切片段内的大片段的插入与缺失 特征特性 特定位点，稳定，共显性 DNA用量大，周期长，同位素,技术路线,第三节 基于PCR的分子标记,94 ,37 ,72 ,PCR procedure,Cycle 1 2分子,Cycle 2 4 分子,RAPD (Randomly Amplified

6、 Polymorphism DNA),一、 RAPD 标记,原理,周期短，操作简单，灵敏度高，DNA用量少,Simple Sequence Repeats SSR,5 repeats,7 repeats,P2 P1,二、SSR标记,A 9 repeats,B 5 repeats,C 13 repeats,PCR,A,B,C,SSR多态性分析示意图,ABC分别代表不同的基因型,原理,SSR引物在大豆中的扩增谱带,（1）数量丰富，广泛分布于整个基因 （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）实验重复性好，结果可靠； （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端

7、的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。,SSR标记的主要特点,三、ISSR标记（Inter-simple sequence repeats）,原理：利用真核生物基因组中广泛存在的SSR序列，设计出各种能与SSR序列结合的PCR引物，对两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增。,四、 SSCP (单链构象的多态性) (Single Strand Conformation Polymorphism),变性 复性,五. DD-PCR (Differential display-PCR),主要原理：,利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3端设计象5-T11GA

8、样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。,AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT GCTTTTTTTT GGTTTTTTTT,提取mRNA； 特定引物（12分之一）反转录； 特定引物和RP结合RT-PCR； 把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较cDNA带，从而找出差别cDNA。,具体操作：,（

9、1）简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的 组成。 （2）所需的mRNA量少。 （3）各样本mRNA的差异可同时进行比较。 （4）扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。,特点,Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP标记,原理,第四节 基于PCR和限制性酶切的分子标记,AFLP procedure,AFLP引物 1.核心碱基序列(core)：与接头互补 2.限制性内切酶识别序列（ENZ) 3.引物3末端的选择碱基(EXT),EcoRI adaptor: 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 3-CTGACGCATGGTTAA5 E0

10、0: 5-GACTGCGTACCAATTC3 MseI adaptor: 3AATGAGTCCTGAGTAG5 M00 5 TACTCAGGACTCAT-3 3GAGTCCTGAGTAGCAG-5,52,51,（1）只需要极少量的DNA模板；（2）不需要Southern杂交；（3）不需要预先知道DNA的序列信息；（4）重复性好，可快速获得大量信息。（5）受专利保护,AFLP 标记的主要特点,主要类型DNA分子标记的比较,第五节 DNA分子标记在植物生物技术中的应用,一、构建高密度的遗传连锁图 在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。DNA分子标记数量丰富，为

11、高密度遗传图谱的制作提供了可能，促进DNA指纹的分析。,二、进行基因定位 基因定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图的建立使目的基因的定位更为方便。,三、遗传多样性和物种亲缘关系 DNA标记可以覆盖整个基因组，能客观、准确地检测物基因组DNA水平的差异。,四、种质鉴定 利用DNA分子标记可以鉴别品种，评估品种纯度，分析农艺性状基因，分离和鉴别遗传材料。,植物育种都是依植株的表型性状进行选择的。DNA 标记的出现使植物育种从表型选择过渡到分子育种 的新阶段。,五、育种中的分子标记辅助选择,第三章 分子图谱的构建,第一节 图谱构建的理论基础,一、染色体

12、遗传理论,(1)体细胞核内的染色体成对存在，其中一条来自父本， 一条来自母本，成对染色体的两个成员是同源的。 (2)每条染色体在个体的生命周期中均能保持其结构上的 恒定性和遗传上的连续性，因而在个体的发育过程中 起着一定的作用。 (3)在减数分裂中，同源染色体的两个成员相互配对，随 后又发生分离，走向细胞的两极，从而形成两个单倍 体性细胞。,二、基因重组和连锁理论,在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独 立、自由组合，同源染色体上的基因产生交换与重 组，交换的频率随基因间距离的增加而增大。 同一染色体上的基因在遗传过程中一般倾向于维系 在一起，而表现为基因连锁。 重组是通过一对同源染色体

13、的两个非姊妹染色单体 之间的交换来实现的。,连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换与重组！,重组型配子占总配子的比例称为重组率。 重组率的高低取决于交换的频率，而两对基因之间的交换频 率取决于它们之间的直线距离。 重组率的值变化于完全连锁时的0%到完全独立时的50%之间。 重组率可用来表示基因间的遗传图距，图距单位用厘摩（centi-Morgan，cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重组率。,三、图谱制作的统计学原理,两个基因座位于同一染色体上且相距较近，则在分离后代中通常表现为连锁遗传。对两个基因座之间的连锁关系进行检测，称为两点测验。 在进行连锁测验之前，必须了解各基因座位的等位基因分离是

14、否符合孟德尔分离比例，这是连锁检验的前提。,（一）两点测验,两点测验杂交图示 遗传作图,假设两座位间存在连锁（r 3；而要否定连锁的存在，则要求似然比小于100:1，即LOD2,（二）多点测验,在事先未知各基因座位于哪条染色体的情况下，可先进行两点测验，根据两点测验的结果，将那些基因座分成不同的连锁群，然后再对各连锁群（染色体）上的座位进行多点连锁分析。,又发现粗翅脉(bi)也位于X染色体上,那么,它与w和y的距离和位置又如何?,不能确定三个位点的顺序,三点测验,1.在测交后代中，如果有6种表型说明没有双交换发生， 两两位点间分别发生了一次单交换 2.牢记亲本类型，然后一次只考虑两个位点与亲本

15、的连锁关系比较。 如：亲本中y与w连在一起，后代中不在一起的必然是发生了交换， 即它们的交换率为1.38，其他位点依次类推。 三个位点间只有单交换时：,一次三点测验即可做出连锁图,（三）交换干扰与作图函数,两个基因座之间便可能在两处同时发生遗传物质的交换，即双交换。在染色体某区段上发生的双交换，其实际频率往往少于由单交换概率相乘所估得的理论值。这是因为一个位置上所发生的交换会减少其周围另一个单交换的发生，这种现象称为交叉干扰。,双交换,1.3+32.8=34.1（理论） 为什么y与m的观察值为33.5？,第二节 作图群体的建立,概念： 遗传连锁图谱：分子标记在染色体上的相对位置或排列情况。,构

16、建分子遗传连锁图谱的步骤,一、亲本的选配,亲本间的DNA多态性,选择亲本时应尽量选用纯度高的材料，并进一步通过自交进行纯化,要考虑杂交后代的可育性,选配亲本时还应对亲本及其F1杂种进行细胞学鉴定,二、分离群体类型的选择,（一）F2代群体,优点：建立F2群体容易,缺点（1）杂合基因型，显性标记，将无法识别显性纯合基因 型和杂合基因型,（2）不易长期保存,（二）BC1群体,（Aa）a,BC1群体中每一分离的基因座只有两种基因型，它直接反映了F1代配子的分离比例，因而BC1群体的作图效率最高,X,（三）RIL群体,RI（重组自交系）群体是杂种后代经过多代自交而产生的一种作图群体，通常从F2代开始，采

17、用单粒传的方法来建立。,RI群体的优点是可以长期使用，可以进行重复试验,（Recombination Inbred Line, RIL）,（四）DH群体,单倍体经过染色体加倍形成的二倍体称为双单倍体（DH）,F1植株的花药进行离体培养，诱导产生单倍体植株， 然后对染色体进行加倍产生DH植株,不同作图群体的特点,常见的作图群体,P1 AA aa P2,F1 Aa aa P2,F2 1AA : 2Aa : 1aa BC1 1Aa : 1aa,单粒传,RI 1AA : 1aa,DH 1AA : 1aa,花培,（永久性）,（永久性）,三、群体大小的确定,作图群体所需样本容量的大小取决于以下两个方面：

18、一是从随机分离结果可以辨别的最大图距， 二是两个标记间可以检测到重组的最小图距。,第三节 DNA标记分离数据的数学处理,DNA标记基因型的表现形式是电泳带型，将电泳带型数字化是DNA标记分离数据进行数学处理的关键。,进行DNA标记带型数字化的基本原则是，必须区分所有可能的类型和情况，并赋与相应的数字或符号。,一、分离数据的收集与数字化,二、遗传图距与物理距离对应关系的估计,三、构建DNA标记图谱的计算机软件,常用软件有LINKAGE、MAPMAKER/EXP等。 LINKAGE软件 ftp:/ /software/linkage MAPMAKER/

19、EXP /distri-bution/software/mapmaker3,第四节 DNA标记连锁图谱的完善,根据分子标记与已知染色体位置的形态标记的连锁关 系来确定分子标记连锁群属于哪条染色体。 利用非整倍体或染色体结构变异材料，如水稻中利用 三体、玉米中利用A/B易位系、小麦中利用缺体/四体 染色体代换系等，将分子标记连锁群归属到相应的染 色体上。,一、DNA标记连锁群的染色体定位,主基因的定位，其平均间隔要求在1020cM或更小。 QTL定位的连锁图，其标记的平均间隔要求在10cM以下。 基因克隆，则要求目标区域标记的平均间隔在1cM以

20、下。,二、饱和DNA标记连锁图的制作,遗传图谱饱和度:是指单位长度染色体上已定位的标记数 或标记在染色体上的密度一个基本的染色体连锁框架图 大概要求在染色体上的标记平均间隔不大于20cM。,遗传图谱达到特定饱和度所需的标记数,第四章 质量性状的分子标记,利用近等基因系分析法和分离体分组混合分析法是快速有效地寻找与质量性状基因紧密连锁的分子标记的主要途径。,第一节 近等基因系分析法,一组遗传背景相同或相近，只在个别染色体区段上存在差异的株系，称为近等基因系（NIL）。,一、近等基因系的培育,二、近等基因系分析法的基本原理,三、近等基因系分析法应用实例,抗、感基因池间引物筛选,F2代单株PCR扩增

21、,MAPMAKER/EXP（V3.0b）分析F2扩增结果,亲本、F1、F2 DNA提取,亲本间引物筛选,Kosambi函数将重组值转换为遗传图距,SSR体系建立,第二节 分离体分组混合分析法（BSA）,Bulked Segregation Analysis,AA,aa,Aa,A基因池,a基因池,BSA法,R,R,r,r,二、 BSA的应用实例,PI296341西瓜抗西瓜枯萎病；97108感病品种,P1296341X9710 F1,F2,利用分子标记迄今已在小麦、玉米、棉花上定位了许多抗病基因、农艺性状基因，如 小麦抗白粉病（P m1、 P m2、 P m3、 P m4a、 P m12 ）基因、

22、抗叶锈基因、抗条锈基因(Yr1-Yr23)、春化反应基因、耐盐基因、育性恢复基因等； 棉花与棉花纤维发生有关的基因、抗黄萎病基因、与长绒和高产性有关的基因等； 玉米如抗大斑病基因、矮生基因、产量性状的基因定位等,第五章 数量性状的分子标记,控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因座（QTL）。利用分子标记进行遗传连锁分析，可以检测出QTL，即QTL定位（QTL mapping）。,第一节 QTL定位的原理和步骤,一、QTL定位的原理,二、QTL定位需要的条件和技术路线,作图群体,分子标记表型数据,分子标记连锁图,数量性状表型数据,QTL定位分析,QTL定位结果,标记作图方法,QTL定

23、位方法,三、QTL单标记定位法,M,M,M,m,m,m,m,m,m,m,m,m,m,m,M,M,（一）t 测验,适用群体 DH RI BC1 以DH群体为例： 设QTL与标记间重组率为 r,t 测验结果的解释,标记均值差的期望值,可见 t 值随重组率（r）的增大而减小； 当 r = 0.5（QTL与标记没有连锁）时，t = 0； 当 r = 0（QTL与标记完全连锁）时，t 值最大； t 值随QTL效应（ QQ qq ）的增大而增大； 当 t t，则接受 t 0，说明存在QTL。,分析示例,（结果显示在标记3附近可能有QTL）,（二）QTL区间定位法,基本思想：用相邻的两个标记检测位于它们之间

24、的QTL 数学模型（以DH群体为例） yi = + bxi + i 式中： yi 某个株系的性状值 模型均值 b 被检QTL的效应值 xi 该株系中被检QTL的基因型指示变量 （QQ：xi = 1; qq: xi = 1） i 误差,各个株系中被检QTL的基因型（亦即回归模型中自变量x*的值）是未知的，但可根据两侧标记的基因型来推算被检QTL为某种基因型（QQ或qq）的概率。,A r1 Q r2 B,a q b,r,假设在某个标记区间中存在一个QTL（如下图）,重组率 r1、r2 和 r 可以利用作图函数从图距换算得到。,注： s = 1 r, t = r1r2,根据两侧标记基因型和标记与QT

25、L间的重组率推算出的QTL各种基因型的概率以及 x* 的期望值,用 x* 的期望值取代其真值，代入回归模型中，即可用最小二乘法进行回归分析，由此可估计出QTL的效应值 b*，并进行显著性测验。,显著性测验的假设 无效假设 H0: 被检测的位置没有QTL，即 b* = 0 备择假设 H1: 被检测的位置存在QTL，即 b* 0,似然比检验 LR = n ln RSS(b* 0) / RSS(b* = 0) 也可用LOD统计量： LOD 0.217 LR 其中： RSS(b* = 0) 无效假设下的最小剩余平方和 RSS(b* 0) 备择假设下的最小剩余平方和,以一定步长（如1 cM），沿整条染色

26、体逐点检测，可以得到LOD（或LR）沿染色体位置变化的曲线。大于显著阈值的LOD曲线高峰所对应的染色体位置就是存在QTL可能性最大的位置。,番茄第10号染色体上与果实性状有关的QTL的区间定位结果,果实pH值,果实重,果实可溶固形物浓度,三、QTL复合区间定位法,基本思想：用标记来消除遗传背景对被检区间的影响 数学模型（以DH群体为例） y = b0 + b*x* + i bi xi + 式中： bi 第 i 标记的偏回归系数 xi 第 i 标记的基因型指示变量 （MM：xi = 1; mm: xi = 1） 其它符号 含义与区间定位模型相同 可以看出，复合区间定位模型比区间定位模型多了一项

27、i bi xi ，称为余因子项，它是性状值对标记的回归项。,QTL定位的计算机软件,t 测验和方差分析 可使用常用的统计软件，如SAS、SPSS等 区间定位 Mapmaker/QTL 复合区间定位 QTL Cartographer 中文版软件 QTL工具箱（QTLKit） 包含了 t 测验、方差分析、联合定位、区间定位和复合区间定位几种方法,第六章 分子标记辅助选择,分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）就是利用与基因紧密连锁的分子标记，对目的基因进行辅助选择，从而实现对基因的有效利用。,第一节 分子标记辅助选择的原理,分子标记辅助选择主要是根据与目标基因紧密连锁的分子标记基因型的检测来推测、获得目标基