药品微生物限度检查方法验证方案

1、药品微生物限度检查方法验证方案 2014年1月15日方 案 审 批1方案起草起草部门签名日 期质量控制部 年 月 日2方案会签部 门签 名日 期QC部长 年 月 日微生物检验员 年 月 日 QA部长 年 月 日3方案批准批 准 人签 名日 期质量负责人 年 月 日4方案实施实施部门职 责质量控制部对验证工作与检验相关的数据的采集与检验验证方案、报告的编写质量保证部负责验证方案和报告的审核对人员进行培训文件进行整理归档质量负责人对验证工作全面主持批准验证方案和报告微生物检验员方案具体实施，并出具检验记录和报告目 录1. 概述2. 仪器设备3. 供试液的制备4. 细菌、霉菌及酵母菌计数5. 控制菌

2、检查6. 验证品种项目表1 微生物限度检查法概述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、真菌数、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。除另有规定外，本检查法中细菌的培养温度为3035，真菌、酵母菌的培养温度为2528，控制菌培养温度为（361）。检验结果的报告以1g、1ml、10g、10ml为单位报告。检验量

3、即一次试验所用的供试品。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的三倍量供试品。2 仪器设备2.1 YXQ-LS-30SII型立式压力蒸汽灭菌器2.2 双人净化工作台 2.3 150A型培养箱2.4 HH.B11-500型培养箱2.5 202-2型干燥箱2.6 微波炉2.7 架盘天平2.8 YJA-电动匀浆仪3 供试液的制备根据供试品的理化特征与生物学特征，可采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需要用水浴加热时，温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。液体供

4、试品：取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。固体供试品：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10供试液。4 细菌、霉菌及酵母菌计数 4.1 计数方法的验证：当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。无特殊情况下，验证周期为一年。 验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

5、4.2 菌种及菌液制备4.2.1 验证用菌株：试验用菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特征。验证菌株培养基培养温度培养时间大肠埃希菌CMCC(B)44102营养肉汤303518-24h金黄色葡萄球CMCC(B)26003营养肉汤303518-24h枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501营养肉汤303518-24h白色念珠菌CMCC(F)98001改良马丁琼脂培养基232824-48h黑曲霉菌CMCC(F)98003改良马丁琼脂培养基23285-7天4.2.2 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于

6、3035培养1824小时。取经3035培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-610-7约为50100cfuml的菌悬液备用。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于2328培养2448小时。取经2328培养2448小时的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50100cfuml的菌悬液备用。接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，于2328培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌

7、氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfuml的菌悬液备用。4.2.3 每ml菌液含菌量的计数测定 测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入1520ml已经过适用性检查确证的温度不超过45的相应的溶化的培养基，混匀，凝固，倒置培养。每个稀释级至少制备2个平板。细菌类别培养温度为3035，培养3天；霉菌、酵母菌类别培养温度为2328，培养5天。4.3 验证方法：验证试验至少应进行三次

8、独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。4.3.1 试验组：平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。4.3.2 菌液组：测定所加的试验菌数。4.3.3 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。4.3.4 稀释级对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组

9、，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每毫升供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。4.4 结果判断：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的均回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中验证组的回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方

10、法或联合适用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么验证试验中微生物回收的失败可看成时因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是，供试品也可能仅对试验用的菌株具有抑制作用，对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检查结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条

11、件进行供试品的检验。验证试验液可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。5 控制菌检查5.1 方法的验证：当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。无特殊情况下，验证周期为一年。验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。5.2 菌种及菌液制备5.2.1 验证用菌株试验菌株培养基培养温度培养时间（小时）大肠埃希菌 CMCC(B

12、)44102营养肉汤30351824金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003营养肉汤30351824乙型副伤寒沙门菌 CMCC(B)50094营养肉汤303518245.2.2 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。每ml菌液含菌量的计数测定。5.2.2 每ml菌液含菌量的计数测定测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入1520ml已经过适用性检查确证的温度不超过45的溶化的营养琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培

13、养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。培养温度为3035，培养3天。5.3 验证方法5.3.1 试验组：取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入赠君培养基中。5.3.2 阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌，阴性对照菌不得检出。5.4 结果判断：阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查

14、法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合适用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。6 验证品种项目表以上品种含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定真菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。附：细菌、霉菌、酵母菌检查方法验证原始记录控制菌检查方法验证原始记录细菌、霉菌、酵母菌检查方法验证原始记录 文件编号：SOP.PC-JT-23-01-02品 名规 格批 号数 量来 源检验日期年 月 日检 验 依 据中国药典2010年版一部报告日期年

15、月 日紫外消毒时间时 分 时 分 记录编号试验用培养基：培养基名称批号培养基名称批号营养琼脂培养基营养肉汤培养基玫瑰红钠琼脂培养基改良马丁琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）一 试验组：营养琼脂培养基 （大肠埃希菌）营养琼脂培养基 （金黄色葡萄球菌）营养琼脂培养基 （枯草芽孢杆菌） 碟号检品12平均 碟号检品12平均 碟号检品12平均1：10供试液+试验菌液50100 cfu1：10供试液+试验菌液50100 cfu1：10供试液+试验菌液50100 cfu玫瑰红钠琼脂培养基（白色念珠菌）玫瑰红钠琼脂培养基（黑曲霉）YPD培养基（白色念珠菌） 碟号检品12平均 碟号检品12平均 碟

16、号检品12平均1：10供试液+试验菌液50100 cfu1：10供试液+试验菌液50100 cfu1：10供试液+试验菌液50100 cfu二 菌液组：取上述试验菌液，测定其加入的试验菌数大肠埃希菌金黄色葡萄球菌碟号稀释级12平均碟号稀释级12平均枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉碟号稀释级12平均碟号稀释级12平均碟号稀释级12平均 三 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落记数方法测定供试品本底菌数细菌总数检查标准规定：不得过 cfug或ml 霉菌、酵母菌总数检查标准规定不得过 cfug或ml取样量：每一浓度吸1ml取样量：每一浓度吸1ml营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养

17、基碟号稀释级12平均碟号稀释级12平均碟号稀释级12平均2平均结果CFUg或ml碟号稀释液12平均结果CFUg或ml10-110-110-1原菌液阴性对照阴性对照阴性对照四 稀释剂对照组：取稀释剂1ml加入50100 cfu试验菌，注皿经培养测定其菌数碟号稀释液菌种12平均PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念球菌黑曲霉五 计算试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数（1） 试验菌组的回收率（%）= _ 100%菌液的平均菌落数 菌种代数菌液组（cfu / ml）试验组（cfu / ml）供试品对照（cfu / ml或g）人工染菌回收率（%）大肠埃希菌细菌金黄

18、色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌霉菌、酵母菌白色念珠菌（YPD培养基）黑曲霉 稀释剂对照组平均菌落数（2） 稀释剂对照组的菌回收率（%）= _100% 菌液的平均菌落数 菌种稀释剂对照组平均菌落数菌液的平均菌落数回收率（%）大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉六 结果判定：稀释剂对照组的菌回收率：试验菌组的菌回收率：若稀释剂对照组和试验菌组的菌回收率均不低于70%，确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。_ 检验人： 复核人： 质检中心主任签名： 日 期： 年 月 日 控制菌检查方法验证原始记录 文件编号：SOP.PC-JT-23-01-03品 名规 格批 号

19、数 量来 源检验日期年 月 日检 验 依 据中国药典2010年版一部报告日期年 月 日 紫外消毒时间时 分 时 分记录编号试验用培养基：培养基名称批号培养基名称批号胆盐乳糖培养基营养肉汤培养基MUG培养基麦康凯琼脂培养基胆盐乳糖发酵培养基一 供试品控制菌检查检查项目：需做的检查在内划“”大肠埃希菌项目BLMUGIEMB革兰染色LacIMViC结果标准规定检品g不得检出g阳性对照阴性对照大肠菌群0. 1g0.01g0.001g阴性对照EMB乳糖发酵管结果标准规定个g小于100个g沙门菌 项目对照肉汤TTBEMB DHLTSIH2SI ULDKVN，动力AF“O”血清结果标准规定凝集对照检品g不得

20、检出g阳性对照阴性对照二 试验组及阴性菌对照组控制菌检查检查项目：需做的检查在内划“”大肠埃希菌 检查方法的验证操作方法：取胆盐乳糖培养基100ml，加入 10ml的供试液及10100cfu试验菌，取胆盐乳糖培养基中的培养物0.2ml，接种到含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。阴性菌对照组同法操作。检品培养基名称供试品 + 试验菌（大肠埃希菌）阴性菌对照组（金黄色葡萄球菌）本底对照胆盐乳糖培养基MUG培养基靛基质结 果大肠菌群检查方法的验证操作方法：取不少于10ml胆盐乳糖发酵培养基管3支，加入1：10供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）及10100cfu试验菌。取上述产酸产气的发酵管中的培养物，分别