定量与常规PCR的差别.ppt

1、定量与常规PCR的差别,Opticon实时荧光定量PCR仪之,常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析 定量PCR技术： 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析 三个关键词：实时，定量，荧光,Opticon实时荧光定量PCR仪之,如何定量？,Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 为什么要用Ct值定量 实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。,定量原理,初始 D

2、NA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,确定初始模板的浓度,Opticon实时荧光定量PCR仪之,SYBR Green 1,Molecular Beacons,TaqMan,荧光化学,Opticon实时荧光定量PCR仪之,Amplifluor,Roche,荧光化学,Opticon实时荧光定量PCR仪之,阴阳探针,R1,R2,SYBR Green I 工作原理,Opticon实时荧光定量PCR仪之,SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1 染料只有和双链

3、DNA结合后才发荧光。,变性 DNA,未结合SYBR Green 1 dye,变性: 无荧光信号,SYBR Green I 工作原理,Opticon实时荧光定量PCR仪之,SYBR Green I 应用范围,起始模板浓度定量 融解曲线分析 -可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体 基因型分析,Opticon实时荧光定量PCR仪之,SYBR Green I 优点,使用方便 - 不必设计复杂的引物 没有序列特异性 - 可以用于不同的模板 便宜 灵敏,Opticon实时荧光定量PCR仪之,SYBR Green I 缺点,与非特异性产物结合,Opticon实时荧光定量PCR仪之,Mole

4、cular Beacons,Molecular Beacons,Opticon实时荧光定量PCR仪之,发夹型杂交探针,Molecular Beacons,原理：荧光谐振能量传递（FRET）,茎由互补配对的序列组成,环与目标序列完全配对,茎,Opticon实时荧光定量PCR仪之,荧光素,淬灭剂,环,变性: 产生非特异性的荧光,Molecular Beacons,Opticon实时荧光定量PCR仪之,Molecular Beacons SNP,T,A,C,C,G,G,G,G,G,T,T,A,C,G,A,A,C,G,G,T,A,A,T,T,T,T,T,G,C,C,C,C,C,A,A,A,A,Q,荧光

5、素,目标序列,茎,淬灭剂,Opticon实时荧光定量PCR仪之,延伸: 没有荧光,Molecular Beacons SNP,Opticon实时荧光定量PCR仪之,Molecular Beacons 应用范围,定量起始模板浓度 基因型分析 鉴定产物 单核苷酸多态性（SNP）检测,Opticon实时荧光定量PCR仪之,Molecular Beacons 优点,对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试剂之一 荧光背景低,Opticon实时荧光定量PCR仪之,Molecular Beacons 缺点,设计困难 无终点分析功能 只能用于一个特定的目标 价格较高,Opticon实时荧光定量P

6、CR仪之,TaqMan,探针,荧光素,淬灭剂,Opticon实时荧光定量PCR仪之,TaqMan,水解型杂交探针,TaqMan,目标特异性探针 5 为荧光素， 3 为淬灭剂,5 荧光素,3淬灭剂,与目标序列互补,Opticon实时荧光定量PCR仪之,TaqMan 工作原理,Opticon实时荧光定量PCR仪之,退火: 无荧光信号,3,3,5,5,模板和探针杂交,延伸: 聚合反应,5,5,3,3,TaqMan 工作原理,Opticon实时荧光定量PCR仪之,3,3,5,5,延伸: Taq酶切下5端荧光素出现荧光,TaqMan 工作原理,Opticon实时荧光定量PCR仪之,TaqMan SNP分析,T,A,C,C,G,G,G,G,G,T,T,A,C,G,A,A,C,G,G,T,A,A,T,G A T C C T A C C,G A T C C C A C C,Opticon实时荧光定量PCR仪之,TaqMan 应用范围,定量起始模板浓度 基因型分析 产物鉴定 SNP分析,Opticon实时荧光定量PCR仪之,TaqMan 优点