大肠细菌的基因芯片鉴定

实验三基因芯片鉴定大肠细菌 基因芯片 ： 是指将特定的 DNA或寡聚 核苷酸 片段通过 物理化学 方法固定于玻璃、尼龙甚至塑料片上 ,使多基因分析可同时进行的一种装置。 基因芯片上可固定不同物种特定基因的探针，将从样品中提取并经 PCR扩增和荧光标记的特异基因片段与基因芯片上的探针杂交，利用专门的光学仪器，能够检测到这些杂交信号（带有荧光标记的双链核酸），杂交信号出现在某物种的探针位点上，说明样品来自于该物种。基因芯片上固定探针的方法通过化学修饰可以使玻片成为表面富含氨基的基片。在中性溶液中，基片上的氨基所带的正电荷与核酸分子上的磷酸所带的负电荷相互作用，使核酸吸附在基片表面。加热和紫外照射可以增强固定效果，但紫外交联容易导致 DNA断裂或DNA分子间形成干扰杂交的网状结构，所以一般还是采用加热固定。本实验使用的基因芯片上固定有大肠杆菌 HSP70基因和黄单胞菌 HTPG基因的特异探针，可用于鉴定这两种细菌。 基因芯片制作和检测的原理实验方案本实验共分为四个部分：一、大肠杆菌培养二、提取大肠杆菌基因组 DNA三、 PCR扩增其 HSP70基因，电泳检测扩增产物四、扩增产物与基因芯片杂交并检测杂交信号第一部分 细菌培养配制 100ml LB液体培养基，蛋白胨 1g，酵母提取物 0.5g，氯化钠 1g，加重蒸水 100ml，用 NaOH调pH至 7.0，高压灭菌。将大肠杆菌单菌落接种于 LB培养基中， 37 恒温摇床上培养过夜，摇床转速约为 280r/min。第二部分提取纯化大肠杆菌基因组DNA第二部分 实验步骤1、 取培养的菌液 10ml， 4000r/min离心 10min，除去上清液。2、加入 1ml TE，使细菌沉淀充分悬浮。3、加入 0.2ml 10% SDS 溶液，再加入 10l 20 mg/ml 蛋白酶 K， 37 水浴中温育 1h。 (SDS溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K能水解消化蛋白质，特别是与 DNA结合的组蛋白。 )4、取出离心管，加入 0.2ml 5mol/L NaCl 溶液，混匀后再加入0.2ml CTAB/NaCl 溶液， 65 水浴中温育 20min。5、加入与菌液等体积（ 1.6ml）的苯酚 /氯仿 /异戊醇混合液，用漩涡混合器混匀， 4000r/min离心 10min。注意吸取混合液前将混合液充分振荡混匀。6、取上层水相至无菌离心管，再加入等体积的氯仿 /异戊醇混合液，用移液器反复吹打混匀， 4000r/min离心 10min。7、将上层水相转移到另一个无菌离心管中，加入 2l RNase A， 37 水浴中温育 30min。8、加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，充分振荡，抽提残留在水相中的苯酚。 4000r/min离心 10min。9、将上清液移至新的离心管中。10、加入上清液 1/10体积的 3mol/L NaAc溶液，以及上清液 2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀以沉淀 DNA。室温下静置 10min， DNA形成白色（或淡黄色）絮状沉淀。11、用移液器轻轻吸住白色絮状沉淀，将其转移到装有适量 75% 乙醇的 1.5ml离心管中。上下颠倒漂洗，洗去杂质。 7500r/min离心 5min。12、去上清液，沉淀干燥后溶解于 100l TE中。取 10 l提取的基因组 DNA溶液加 1.99ml水稀释后测量 OD260，蒸馏水作为空白，计算 DNA产量（ 1 OD260 50 g DNA/ml）。-20 贮存其余基因组 DNA，待下一实验用作PCR反应的模板。 DNA产量测定 试 剂1、 TE： 10mmol/L TrisHCl， 1mmol/L EDTA2、 CTAB（ 十六烷基三甲基溴化铵 ） / NaCl： 将 4.1g NaCl溶解 于 80ml水中，缓慢加入 10g CTAB，定容至 100ml。3、 苯酚 /氯仿 /异戊醇混合液： 水饱和酚 : 氯仿 : 异戊醇 = 25 : 24 : 1（体积比）。4、 氯仿 /异戊醇混合液： 氯仿 : 异戊醇 = 24 : 1（体积比）。5、 10g/l RNase A 10% SDS20 mg/ml 蛋白酶 K 5mol/L NaCl3mol/L NaAc 无水乙醇 75% 乙醇 。第三部分 PCR扩增组 分 剂 量（ l） 基因组 DNA模板 10-100ng10Taq Buffer 34dNTP（各 10mol/L） 0.5上游引物（ HEX标记） 1下游引物（ HEX标记） 1Taq DNA聚合酶 (2.5U/ l) 0.5dH2O （随模板体积变化）总体积 30PCR反应程序阶段 温度 时间 起始变性 94 3min 变性 94 30s 循环 30次 退火 60 30s延伸 72 45s最后延伸 72 10min 第四部分基因芯片杂交和检测每个阵列的探针排布标记有 HEX的核酸（无标记的大肠杆菌HSP70基因扩增产物）（无标记的黄单胞菌HtpG基因扩增产物）50%DMSO器材耗材软件实验步骤（ 1）准备芯片：去掉杂交围栏上的胶纸，将杂交围栏放在杂交模具中心的同样形状的凹槽中，胶面朝上，注意要使杂交围栏与凹槽契合。用手捏着芯片上贴有标签纸的一端，将芯片另一端顶着模具的顶端，然后将芯片正面（贴有标签纸）朝下放入模具。在芯片背面相应位置用镊子轻轻向下按，使杂交围栏紧贴在芯片上。撕去围栏上的保护纸贴 围 栏第四部分 实验步骤（ 2）往杂交盒底部凹槽中均匀加入少量蒸馏水（约200 l），以防止杂交过程中杂交液大量挥发。把芯片有杂交围栏的一面朝上放入杂交盒中，按芯片摆放方向盖上盖片，注意使盖片上的凸面朝下。盖片芯片标签端盖片正面观往杂交盒底部的凹槽中加水将贴好围栏的芯片放入杂交盒注意：围栏朝上盖上盖片注意：盖片的凸起面向下第四部分 实验步骤（ 3）杂交：将杂交液用移液器混匀后 3000r/min离心 30s， 95 热变性 3min。冰浴骤冷 1min。用移液器将杂交液注入盖片上的小孔。盖上 杂交盒的盖板，两侧用两个卡子扣上，确保杂交盒的密封性。 在 42 水浴中杂交 2小时。加杂交液盖上盒盖，插上卡子放入恒温水浴中保温第四部分 实验步骤（ 4）清洗： 洗液先预热至 42 。 将芯片转移到盛放