医学ppt课件大全蛋白质相互作用的研究方法

姓名：王连连 导师：梁建生 专业：植物学 蛋白质相互作用的研究方法 人类蛋白质组相用 有一些蛋白质可以以 单体 的形式 发挥作用，但是大部分的蛋白质 都是和 伴侣分子 或是与 其他蛋白 质 一起发挥作用的。 举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现， 然而单纯的基因组 DNA序列尚不能解答许多生命问题。 基 因 是相对 静态 的，而基因编码的产物 蛋白质 则是 动态 的 ，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行 者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与 生物功能相关。 在所有生命活动中， 蛋白质之间的相互作用 是必不可 少的，它是细胞进行一切代谢活动的 基础 。细胞接受外源 或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的 表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有 很重要的地位，它可以调控 , 介导细胞的许多生物学活性 。 为了更好地理解细胞的生物学 活性，必须很好地理解蛋白质单体 和复合物的功能，这就会涉及到蛋 白质相互作用的研究。因此，揭示 蛋白质之间的相互作用关系、建立 相互作用关系的网络图，已成为蛋 白质组学研究中的热点。研究蛋白 质相互作用的方法也就具有更为重 要的意思。 免疫共沉淀 荧光共振转移技术 噬菌体展示技术 酵母双杂交技术 基因外抑制子 合成致死筛选 分子生物学方法 亲和印迹 Pull down 试验 遗传学方法 蛋白质相互作用研究方法 生物物理学方法 融合蛋白 pull-down实验 融合蛋白 pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固 定于某种基质上 (如 Sepharose),当细胞抽提液经过该基质 时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有 被吸附的 “ 杂质 ” 则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通 过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。 为了更有效地利用 pull-down技术，可以将待纯化地 蛋白以融合蛋白地形式表达，即将 “ 诱饵 ” 蛋白 与一种易 于纯化地 配体蛋白 相融合。 1988年 Smith等利用谷胱甘肽 S转移酶（ glutathione-S-transferase ,GST）融合 标签从细菌中一步纯化出 GST融合蛋白。从此 GST融合蛋白 在蛋 白质相互作用研究领域里得到极大的推广。 GST融合 蛋白在经过固定有 GST(glutathione)的色谱柱时，就可以 通过 GST 与 GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物 过柱，就可得到能够与 “ 诱饵 ” 蛋白相互作用的兴趣蛋白 。一般来说 GST融合蛋白 pull-down方法用于两个方面： 一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用 洗脱 （ 2） 结合 （ 3） 检测 （ 6） 收集 （ 5） 洗脱 （ 4） 固定诱 饵蛋白 （ 1） 噬菌体展示 噬菌体展示技术 是在深刻理解噬菌体遗传学 和生理学特性的基础上产生的。 其 原理 是将蛋白 质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目 的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异 结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过多轮 的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与 配基特异作用的蛋白质。 丝状噬菌体 蝌蚪形噬菌体 噬菌体、 T4噬菌体、 T7噬菌体M13噬菌体 流程图 酵母双杂交 1989年 Field等发明了 酵母双杂交系统 。该系统利用 了酵母的生长转录因子 GAL4含有的两个结构域 , DNA 结合 域 (DNA binding domain, BD)及 转录激活 (activation domain,AD),将已知基因 (诱饵基因 )和 靶基因 或含有靶基 因的 cDNA分别构建在含 BD及 AD质粒载体上 ,当这两种质粒 共同转化酵母感受态细胞 ,若 BD结合的诱饵蛋白能够与 AD 结合的靶蛋白或文库中某些 cDNA编码的蛋白相互作用、彼 此间 结合 时 ,则会导致位于侧翼的 BD 与 AD在空间上接近 , 呈现 GAL4 转录因子的完全活性 ,启动下游的报告基因如 His及 LacZ等基因的表达 ,从而在特定的缺陷培养基上 生长 。 因此 ,利用酵母双杂交系统能够 筛选 与诱饵蛋白相互作 用的蛋白，还可以研究已知蛋白间的相互作用 ,用酵母双 杂交技术筛选 cDNA文库分离与诱饵蛋白相互作用的蛋白 或研究蛋白间的相互作用， 一般首先考虑的问题是诱饵载 体的构建。 编码诱饵蛋白的基因经 酶切 处理后，按照正确 的读码框与诱饵载体如 pGBTK7相 连接， 再经酶切或测序 做进一步的验证分析。构建好诱饵载体还要同时 转化 诱饵 蛋白酵母菌株如 Y187 和靶蛋白酵母菌株如 AH109，进行 毒性 和 自激活性 检测，证明诱饵蛋白的表达对酵母正常生 长没有毒性 ,同时也不能自身激活酵母报告基因的表达 ,可 用于筛选文库或研究蛋白间的相互作用。 第二个要考虑的问题就是靶蛋白载体或酵母双杂交 cDNA文库的构建。 一般在编码靶蛋白的基因或 cDNA两端 加上同源 重组序列， 然后与靶蛋白载体如 pGADT72Rec共 同 转化 靶蛋白酵母菌株如 AH109,在酵母同源重组酶的作 用下 ,靶蛋白基因或 cDNA序列 整合 到载体上 ,完成靶蛋白载 体或 cDNA文库的构建。最后一步就是筛选文库或直接研 究两个蛋白间的相互作用。分别含有诱饵蛋白载体和靶蛋 白载体的酵母 杂交 后 ,在酵母体内融合 表达 BD2诱饵和 AD2 靶蛋白。诱饵蛋白和靶蛋白的相互作用 ,导致位于侧翼的 BD与 AD在空间上接近，呈现 GAL4转录因子的完全活性 ，启动下游的报告基因如 Ade、 His及 LacZ等基因的表达 ，根据报告基因的表达情况，从而达到分离蛋白或研究蛋 白互作的目的。 蛋白质组学的发展促进了多种研究技术的开发和完善 ，越来越多的技术趋向于大规模、高通量方向发展。同时 ，物理学、化学、信息学等基础学科研究的发展也大大促 进了这些技术的改进。新近发展的计算机分析方法，以基 因序列和基因组信息为基础预测蛋白质相互作用，并涉及 对参与蛋白质相互