医学课件免疫检测

免疫 检测 爱博泰克 更多医学精品 尽在医学吧 /rayshiu 常用免疫 检测 方法 待 测 的 样 品 定位、定性及定量研究 IHC 组织 (细 胞 ) 定性、定位 ELISA 血清、血 浆 、尿液、 细 胞 或 组织 培养上清液（分泌 型蛋白） 定性、定量 WB 蛋白 质样 品 定性、半定量、（ 间 接定 位：胞 浆 胞核胞膜蛋白分 离出来分 别 做 wb） IHC(免疫 组 化 Immunohistochemistry) 是融合了免疫学原理 (抗原抗体特异性 结 合 )和 组 织 学技 术 (组织 的取材、固定、包埋、切片、脱 蜡、水化等 )，通 过 化学反 应 使 标记 抗体 的 显 色 剂 (荧 光素、 酶 、金属离子、同位素 )显 色，来 对 组织 (细 胞 )内抗原 进 行定位、定性及定量的研究 ( 主要是定位 )。 样 本是 细 胞或 组织 ，要在 显 微 镜 下 观 察 结 果，可能出 现 膜阳性、 质 阳性和核阳性 。 ELISA(酶 联 免疫吸附 试验 Enzyme linked immunosorbent assay) 用到了免疫学原理和化学反 应显 色，待 测 的 样 品 多是血清、血 浆 、尿液、 细 胞或 组织 培养上清液 ，操作上 开始需要将抗原或抗体 结 合到固相 载 体表面，从而使后来形成的抗原 -抗体 -酶 -底物复 合物粘附在 载 体上， 这 就是 “吸附 ”的含 义 。 WB (蛋白 质 印迹 Western Blot) 先 进 行 SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白 质样 品用 电转仪转 移到固相 载 体上，而后利用抗原 - 抗体 -标记 物 显 色来 检测样 品，可以用于定性和 半定量。 Western Blot 步骤2 原理31 其他3 原理 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质， “探针 ”是抗体， “显色 ”用标记的二抗。 经过 PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载 体（硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键 形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类 型及其生物学活性不变（这个过程就是转膜） 。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对 应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体 起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异 性目的基因表达的蛋白成分。 Protein ProteinBlocking Agent Blocking AgentBlocking Agent Membrane Primary Antibody Secondary Antibody/Enzyme (E) E E ss s s s s s ss ProductPP P PP 步骤 样品处理 凝胶电泳 样品印迹 免疫检测 结果分析 样 品制 备 组织 、 细 胞、裂解液、蛋白 酶 抑制 剂 、 Loading Buffer 一般比例：新 鲜组织 1:1020裂解液， 细 胞 107- 1ml裂解液，制 备 高 浓 度 样 品可酌情减少裂解液 裂解液成分： ph7.27.5的 tris-hcl缓 冲体系，有 效裂解成分多 为 去 污剂 NP-40, Triton X-100，去 氧胆酸 钠 蛋白 酶 抑制 剂 ： PMSF,COCKTAIL Loading Buffer：甘油， sds， 还 原 剂 （ DTT或 2- 巯 基乙醇） 样品制备 上样缓冲液处理蛋白质样品 SDS： 阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与 SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS胶束。 蛋白质 -SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除 了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂 (巯基乙醇）一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线 性化。 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 四甲基乙二胺（ TEMED) 丙烯酰胺 N,N-亚甲基双丙烯酰胺 过硫酸铵（ AP) 激活作用 聚丙烯酰胺共聚合 提供自由基 分离胶 分离胶母液 10%AP TEMED 浓缩胶 浓缩胶母液 10%AP TEMED 灌制分离胶 加入异丙醇 灌制浓缩胶 上样与电泳 Staking gel Separating gel 样品印迹 转膜：要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体 （例如 NC膜）上。 蛋白质带负电荷 ，凝胶在负极一 侧，硝酸纤维素 膜在正极一侧， 接通电源以后， 蛋白质 由负极向 正极 转移至膜上 。 免疫检测 封闭 一抗、二抗孵育 二抗与底物反应显色 曝光曝光 免疫检测 封闭 ： 为避免 NC与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异 性结合，使非特异性背景提高，需对 NC上的潜在结合位 点进行封闭处理。 5%脱脂奶粉（脱脂奶粉脱脂奶粉（脱脂奶粉 +PBST) Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原 的结合。的结合。 免疫检测 一抗、二抗孵育： 把 NC膜放在培养皿中，加入一抗溶液，摇床上平 缓摇动，于室温孵育 1小时。 倒掉一抗溶液，用 PBST漂洗膜 4次，每次 5min。 加入用 PBST配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室 温孵育半小时。 倒掉二抗溶液，用 PBST漂洗膜 4次，每次 5min。 免疫检测 二抗与底物反应显色（ ECL显色） 分类 1、放射自显影 2、底物化学发光 ECL 3、底物荧光 ECF 4、底物 DAB显色 发光液 A和 B分别是鲁米诺和过氧化氢，在辣根过氧化物 酶（ HRP）的催化