fhit基因异常转录与宫颈癌相关性的研究

【摘要】 目的 探讨脆性组氨酸三联体（ FHIT）基因与宫颈癌发病的关系。方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应（nested RT-PCR) 及 DNA 直接测序法对 15 例正常宫颈组织、 30 例宫颈癌组织及配对癌旁正常组织、宫颈癌 Hela 细胞系进行 FHIT 基因异常转录分析， 并选择 1 例正常转录本及 2 例异常转录本进行 DNA 序列分析。结果 除 7 例宫颈癌组织 及 1 例癌旁正常组织外，其余标本均扩增出 FHIT 基因野生型转录本。Hela 细胞系同时存 在野生型及异常转录本。FHIT 基因的异常转录率在宫颈癌组织为 47%（14/30 ） ，高于癌旁 正常组织 20%（6/30）及正常宫颈组织 13%（2/15） ，差异均有显著性（P0.05)。FHIT 基 因的异常转录与癌组织的生物学特性无关。DNA 测序证明异常转录本为 FHIT 基因多个外 显子的缺失及 DNA 序列的插入。结论 FHIT 基因的异常转录是宫颈癌组织及 Hela 细胞系 中的常见事件，可能与宫颈癌的发生有关。 【关键词】 子宫颈肿瘤；基因脆性组氨酸三联体；逆转录聚合酶链反应；转录；遗 传 Study on association of aberrant fragile histidine triad gene transcripts with human cervical cancer LI Fu-qin,WANG Wei. Department of Obstetrics and Gynecology,The 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,China 【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the fragile histidine triad (FHIT) gene and human cervical cancer.Methods Normal cervical tissues from 15 patients,cancerous and matched adjacent normal tissues from 30 patients with cervical cancer and Hela cell line were examined for abnormalities of the FHIT gene transcripts by nested RT-PCR.1 normal and 2 abnormal samples were selected for DNA direct sequencing.Results Wild-type FHIT gene transcripts were found in all samples except 7 cancerous tissues and 1 adjacent normal tissues.There were wild-type and aberrant transcripts in Hela cell line.Abnormal FHIT gene transcripts were obtained from 47%(14/30) cancerous tissues,20%(6/30) matched adjacent normal tissues and 13%(2/15) normal tissues.The rate of aberrant FHIT transcripts in cancerous tissues was significantly higher than that in their matched adjacent normal tissues and normal tissues(P0.05).Clinicopathological analysis of patients showed that aberrant transcripts of the FHIT gene had no correlation with biological features of the tumors.Sequence analysis of the aberrant transcripts confirmed the absence of several exons of the FHIT gene and insertions of DNA sequences.Conclusion The expression of aberrant FHIT gene transcripts is common in cervical cancer and Hela cell line.Abnormalities of the FHIT gene may be associated with cervical tumorigenesis. 【Key words】 cervix neoplasms;genes FHIT;RT-PCR;transcription;genetic 3p 染色体的杂合性缺失是宫颈癌中的常见事件，提示可能隐伏着与宫颈癌发生相关的 抑癌基因。自 1996 年 Ohta 等1用外显子捕获法在 3p14.2 区克隆出脆性组氨酸三联体 （fragile histidine triad,FHIT)基因以来，已在多种恶性肿瘤细胞系及原发肿瘤中检测到该基 因的异常，主要包括基因的纯合性缺失、杂合性缺失及异常转录。有关宫颈癌中 FHIT 基 因的研究在国外虽日趋深入，但结果不尽相同，本研究采用巢式 RT-PCR 及 PCR 产物直接 测序法检测了正常宫颈组织、宫颈癌组织及其配对癌旁正常组织、宫颈癌 Hela 细胞系中 FHIT 基因的表达，以期从转录水平阐明 FHIT 基因异常与宫颈癌发生及癌组织生物学特性 的关系。 1 材料与方法 1.1 材料来源 收集 2001 年 411 月我院妇产科手术切除的 30 例宫颈癌标本及同一 患者距癌组织最远处的癌旁正常组织各 0.10.5cm3，取因良性肿瘤手术切除的正常宫颈组 织 15 例作为对照，所有标本术后迅速置液氮内冷冻，然后贮存于-70深冻冰箱中。手术 患者术前均未经过放疗、化疗。所有宫颈癌标本均经术后病理证实，其中鳞癌 26 例，腺癌 4 例；期 12 例，期 18 例；年龄 2762 岁，平均 46.5 岁。宫颈癌 Hela 细胞均已妥善 冻存。 1.2 方法 1.2.1 总 RNA 提取 按照厂商介绍的方法，应用 TRIzol 试剂（GIBCO BRL 公司）提 取组织及细胞中总 RNA，溶于无 RNA 酶的 DEPC 水中。取 1lRNA 于 DNA、RNA、蛋 白浓度测定仪上测定其浓度及 OD260/OD280 值，选择此值1.6 的样品稀释至 1g/l,- 70冻存备用。 1.2.2 逆转录 取 1g 总 RNA，用 Reverse Transcription System(Promega 公司）试剂 盒进行逆转录合成 cDNA 第一链，引物为 Oligo(dT)15。 1.2.3 巢式 PCR 以巢式 PCR 法扩增出 FHIT 基因 Exon3Exon10707bp 的片段，引 物序列参照文献1 。外引物 5U2：5-ATCCTGGAAGCTTTGAAGCTCA-3,3D2:5- TCACTGGTTGAAGAATACAGGA-3;内引物 5U1：5-TCCGTAGTGCTATCTACATC- 3，3D1：5-CATGCTGATTCAGTTCCTCTTGG-3。以 -actin509bp 长的片段作为内对照， 引物序列为：P1:5-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3,P2:5- CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3。第一轮 PCR 反应：20l 反应体系中含 cDNA 模板 2l,dNTP(10mM)1l,MgCl2(25mM)1.5 l,FHIT 基因外引物 5U2、3D2 或 -actin 引物 P1、P2（10mM)各 2l,Taq 酶（5u/ l)0.3l,10Buffer 2l。在 PE Biosystems 9700 型 PCR 仪上进行扩增，条件如下： 95预变性 5min，然后 9530s、5830s、7230s 共 35 个循环，72延伸 10min。将第一轮 PCR 反应产物稀释 20 倍后取 2l 作为模板，以内引 物 5U1、3D1 按第一轮反应体系及条件进行第二轮 PCR 反应。同时设置以总 RNA 为模板 进行巢式 PCR 反应的阴性对照。 1.2.4 产物检测 各取 8l 第一轮及第二轮 PCR 反应产物上样于 2%的琼脂糖凝胶 （含 EB）进行电泳，紫外灯下观察 -actin 及 FHIT 基因两轮 PCR 产物条带，并摄影记录。 1.2.5 DNA 测序 选择第二轮扩增宫颈癌旁正常组织中 FHIT 基因正常大小 707bp 转 录本 1 例及宫颈癌组织中大小约 250bp、350bp 的异常转录本各 1 例，扩大反应体积至 50l 重复 PCR 反应。取 40l PCR 扩增产物进行 2%低熔点琼脂糖凝胶（含 EB）电泳， 在紫外灯下观察并回收 FHIT 基因 mRNA 转录片段。应用 Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega 公司）纯化回收扩增片段。应用上游引物 5U1 及荧光素标记的 dNTP(PE 公司测序试剂盒）扩增纯化后的 cDNA,在 ABI PRISM TM377 自动测序仪中进行 测序。 1.2.6 统计学方法 两样本率的比较采用四格表 2 检验或 Fisher 精确概率法进行统 计分析。 2 结果 2.1 RT-PCR 结果 2.1.1 各标本电泳结果 所有标本 cDNA 经第一轮 PCR 扩增，电泳均可检测到 - actin509bp 的完整条带，但均未检获 FHIT 基因扩增产物；经第二轮扩增后除 7 例癌组织及 1 例癌旁正常组织外，其余标本均检测到 FHIT 基因 707bp 野生型转录本。其中 15 例正常 宫颈上皮组织中 2 例（13%）同时存在约 250bp 的异常转录本。Hela 细胞系同时存在 707bp 及约 300bp 两种形式的转录本。见图 1。在 30 例宫颈癌标本中，23 例（77%）有 FHIT 基因 707bp 正常转录，其中 7 例同时存在 12 条短片段的异常转录，其余 7 例（23% ） 癌组织中并无正常大小转录本的扩增，包括 1 例转录缺失及 6 例不同大小的短片段异常转 录。在异常转录中，以 250bp 及 350bp 片段较常见，且 1 例同时出现这两种异常转录。在 30 例癌旁正常组织中，只有 1 例（3%）未扩增出 707bp 片段而只有 250bp 小片段异常转 录本，5 例（17%）同时存在正常及异常转录本。以 RNA 为模板的阴性对照均未扩增出任 何条带，见图 2。 图 1 图 2 略 2.1.2 FHIT 基因在正常宫颈组织、宫颈癌组织及癌旁正常组织中转录情况的比较 见 表 1。FHIT 基因的异常转录率在宫颈癌组织（ 47%，14/30）高于正常宫颈组织 （13%，2/15） ，差异有显著性（P0.05) ，同时高于癌旁正常组织（20% ，6/30 ） ，差异有 显著性（P0.05)。 2.1.3 FHIT 基因异常转录与宫颈癌组织生物学特性的关系 见表 2。基因的 异常转录在宫颈癌临床分期、组织类型、分化程度、淋巴转移及肿瘤大小之间差异均无显 著性（P0.05)。 表 1 FHIT 基因在正常宫颈组织、宫颈癌组织及癌旁正常组织中转录情况的比较 略 表 2 FHIT 基因异常转录与宫颈癌组织生物学特性的关系 略 图 3A 略 2.2 测序结果 选择 1 例癌旁正常宫颈组织约 707bp 的扩增产物进行测序，与 Genebank FHIT 基因 cDNA 序列相比较，结果一致，证实有 FHIT 基因 Exon3Exon10 的 完整转录。选择宫颈癌组织异常转录本中大小约 350bp、250bp 的扩增产物进行测序，证实 1 例为 331bp，Exon5Exon8 缺失，同时在 Exon4 和 Exon9 之间存在一段不明来源的 98bp 序列的插入（图 3A） ，另 1 例为 249bp，Exon4Exon8 部分缺失（图 3B） 。 图 3B 略 3 讨论 现已公认肿瘤是一种基因型疾病，多种癌基因和抑癌基因的协同作用导致肿瘤的发生 发展。研究发现常发生染色体缺失的部位可能有抑癌基因的存在，而脆性位点增加肿瘤形 成中染色体缺失的可能性。故 FHIT 基因，作为第一个将脆性位点与肿瘤联系起来的候选 抑癌基因，备受研究者们的关注。目前已发现该基因在多种实体瘤，如肺1 、肾2 、 宫颈3 、消化道2及头颈部肿瘤4中存在异常转录，表现为外显子的缺失及内源 序列的插入，同时伴有 DNA 的缺失及 FHIT 蛋白的表达减少或缺失3,5,6 。 FHIT 基因位于 3p14.2 区，包含 t（3；8）易位断裂点及脆性部位 FRA3B。该基因全 长 1Mb，共 10 个外显子，其中 Exon5Exon9 为开放性阅读框（ORF） ，编码 16.8kD 的蛋 白质2 ，后者是一种 Ap3A 水解酶，能水解 ApnA(n=36)生成 ADP 和 AMP7 。内含 子 4 中存在 HPV16 整合位点，宫颈癌中 HPV16 整合在此位点可导致包括 Exon5 的大片段 基因的缺失8 。 宫颈组织中对于 FHIT 基因异常转录频率的分析，各试验所得结果不一致，在癌组织 中为 30%80%，正常组织中为 040%3，914 。本实验采用巢式 RT-PCT 法，检测 了 15 例正常宫颈组织，30 例宫颈癌及其癌旁正常组织及宫颈癌 Hela 细胞系中 FHIT 基因 的转录情况。结果显示，所有标本的 cDNA 均经第二轮 PCR 扩增方能检获 FHIT 基因扩增 产物，表明在宫颈组织中 FHIT 基因普遍以低水平表达，这与其他学者在胃肠道肿瘤等其 他肿瘤中得到的结果一致15 。实验结果显示，FHIT 基因的异常转录率在宫颈癌组织高 于正常宫颈组织及癌旁正常组织，这与 Su11 、Yoshino12 、Segawa14得到的结 论相似，初步证明 FHIT 基因的异常转录与宫颈癌的发生密切相关。本实验中 23%（7/30）的癌组织中只扩增出不同大小的异常转录片段，无野生型转录本存在，其中 包括 1 例转录缺失，说明 FHIT 两等位基因均失活。 与其他实验者11，12，14得到的结论相似，笔者发现部分有 FHIT 异常转录的癌 组织中同时含有正常转录本，这种现象可能因肿瘤组织混有正常细胞或肿瘤细胞存在异质 性，即癌灶由不同的细胞克隆构成，其癌变是由于不同的基因改变方式所致。宫颈癌 Hela 细胞系中亦同时存在正常与异常转录本，这与 Druck 等5得到的结果相似，说明 FHIT 基因的改变并非完全是克隆性的。由此推测 FHIT 基因可能通过不同于经典抑癌基因的失 活机制起作用，FHIT 基因变异可能发生在单等位基因上，剩余的等位基因仍能转录野生型 cDNA。 同时实验结果显示，13%（2/15）的正常细胞中也存在 250bp 的异常转录，许多学者 在其他正常组织中亦得到相似结论16，17 ，并且发现衰老细胞中这种异常转录所占比例 增加18 ，这一转录本同时在 5 例癌旁正常组织及 3 例癌组织中出现，推测正常情况下 FRA3B 脆性位点就有一定频率的断裂，它只反映了 RNA 断裂保守性的下降并非肿瘤特异 性，如果此种损伤达到一定程度亦可能导致细胞癌变。本实验另一常见异常转录为 331bp 片段，由于此种异常转录仅在癌组织中及 1 例癌旁正常组织中出现，正常组织中并不存在， 推测可能为肿瘤特异性的异常转录，与正常组织中的异常转录本相比由不同机制产生，与 文献报道一致11 。此例癌旁正常组织中的异常转录可能是由于部分已发生癌变的组织造 成的。本实验 2 例异常转录均存在 Exon5 及 Exon8 的缺失，由于 Exon5 是编码功能蛋白质 的第一外显子，而 Exon8 编码三原组氨酸功能区，故它们的缺失可导致 FHIT 基因功能蛋 白质的产生缺如。按照 Barnes 等7的推测可能使 FHIT 蛋白抑制细胞增殖和（或）促进 细胞凋亡的功能丧失，从而引起组织细胞异常增生而致使机体肿瘤的发生。Exon4 的缺失 提示在宫颈癌的发生中，FHIT 非编码区可能发挥某种调控作用，从而影响 FHIT 基因表达 和 FHIT 蛋白的功能。 本实验同时考察了 FHIT 异常转录与宫颈癌临床分期、病理类型、有无淋巴结转移及 肿瘤大小的关系，证实 FHIT 异常转录与宫颈癌的生物学特性无关，与段晓明等15在 大肠癌组织中研究 FHIT 异常转录得到的结论一致。 本实验通过巢式 RT-PCR 方法在转录水平证实了 FHIT 基因异常转录确与宫颈癌的发 生密切相关，但与癌组织生物学特性无关，经 DNA 测序证实异常转录本涉及多个外显子 的缺失，并且推测其中一种异常转录可能为肿瘤细胞特有的转录形式。虽然该基因可能并 非通过经典抑癌基因的途径发挥作用，但越来越多的研究结果显示重建 FHIT 基因的表达 能有效诱导凋亡及抑制宫颈癌细胞系在动物体内的成瘤性19 。研究并阐明 FHIT 基因异 常转录的确切机制、FHIT 蛋白的功能以及对细胞增殖与凋亡的调节作用，可能为阐明包括 宫颈癌在内的多种肿瘤的发生机制提供新的线索，为其早期诊断、预后及基因治疗提供理 论依据。 【参考文献】 1 陈春林, 张随学 . 在体女性盆腔动脉血管网数字化三维模型构建方法及意义J. 中 国实用妇科与产科杂志. /yxyy/main/index.php.2011(04) 2 徐玉静,欧阳振波,刘萍,陈春林. 磁共振成像在子宫肌瘤动脉栓塞术中的应用价值 J. 中国实用妇科与产科杂志. 2011(04) 3 方驰华,苏仲和. 数字医学技术在胰腺肿瘤诊断和可切除性评估中的研究J. 实用 医学杂志. /xyfm/class/. 2010(10) 4 欧阳振波, 刘萍,余艳红. 女性骨盆研究进展及意义 J. 中国实用妇科与产科杂志. /chuanmei/class/.2010(02) 5 刘萍,余艳红,陈春林,欧阳振波,宋小磊,王宏琢,昌仁民,王建平. 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