pi3kakt通路芯片检测方法

AKT/PKB 信号通路蛋白质磷酸化检测抗体芯片（PAB216） ? ? ? ? ? 产品介绍 Ser/Thr 蛋白激酶 AKT（v-Akt Murine Thymoma Viral Oncogene）又名 PKB (Protein Kinase-B)，在细胞因子、生长因子、荷 尔蒙及分裂素等胞外信号分子与 RTKs（Receptor Tyrosine Kinase）结合引起的下游信号转导过程中起着核心作用。 AKT/PKB 信号通路激活主要引起抗凋亡和促细胞增殖效应，进而在转录因子调节、蛋白合成、细胞周期、凋亡与代谢中发挥 关键作用。AKT/PKB 信号通路与 NF-B、ERK、JNK 、Apoptosis 等信号通路密切相关，在 2 型糖尿病、肿瘤等疾病的病理发 展中的作用日益明确。 AKT/PKB 通路蛋白质磷酸化检测抗体芯片（PAB216） ，采用三维高分子膜专利技术，在片基上共价结合 216 种高特异抗 体，并运用特有的荧光标记技术进行样本标记，以实现对 AKT/PKB 经典信号通路的高覆盖检测。芯片提供信号蛋白多个关键 磷酸化位点的同步检测，针对每一个特定蛋白磷酸化位点，设置一对抗体分别检测其磷酸化（Phospho）和非磷酸化（non- Phospho）状态。同时，芯片可检测多种已有文献报道的非 AKT/PKB 经典通路的信号蛋白，极大扩展 AKT/PKB 单一信号通 路研究的延伸性。 检测特点： 1. 芯片规格为 76 x 25 x 1 mm； 2. 实现单一信号通路全面筛选； 3. 每种抗体设置 6 次技术重复； 4. 适用于组织、细胞等多类型样本； 5. 5106 细胞、200 g 总蛋白量即可满足实验； 6. 每个检测位点设有磷酸化和非磷酸化配对抗体； 7. 可通用于人、小鼠、大鼠等多类型模式生物检测。 检测原理： 检测列表： ? 14-3-3 theta/tau (Ser232) ? 14-3-3 (Ser58) ? 14-3-3 / (Thr232) ? PFKFB2 (Ser483) ? AKT (Ser473) ? AKT (Thr308) ? AKT (Tyr326) ? AKT1 (Ser124) ? AKT1 (Ser246) ? AKT1 (Thr450) ? AKT1 (Thr72) ? FOXO1/3/4-PAN (Thr24/32) ? FOXO1A (Ser329) ? FOXO1A/3A (Ser322/325) ? Gab1 (Tyr627) ? Gab1 (Tyr659) ? Gab2 (Tyr643) ? GABA-RB (Ser434) ? GSK3a-b (Tyr216/279) ? GSK3 (Ser21) ? p53 (Ser378) ? p53 (Ser392) ? p53 (Ser46) ? p53 (Ser6) ? p53 (Ser9) ? p53 (Thr18) ? p53 (Thr81) ? p70S6K (Ser371) ? p70S6K (Ser411) ? p70S6K (Ser418) ? p70S6K (Ser424) ? AKT1 (Tyr474) ? AKT1S1 (Thr246) ? AKT2 (Ser474) ? BAD (Ser112) ? BAD (Ser134) ? BAD (Ser136) ? BAD (Ser155) ? BAD (Ser91/128) ? BCL-2 (Ser70) ? BCL-2 (Ser87) ? BCL-2 (Thr56) ? BCL-2 (Thr69) ? BIM (Ser69/65) ? Cyclin D1 (Thr286) ? eNOS (Ser1177) ? eNOS (Ser615) ? eNOS (Thr495) ? FAK (Ser910) ? FAK (Tyr397) ? FAK (Tyr407) ? FAK (Tyr576) ? FAK (Tyr861) ? FAK (Tyr925) ? FKHR (Ser256) ? FKHR (Ser319) ? GSK3 (Ser9) ? IKK (Thr23) ? IKKa/b (Ser180/181) ? IRS-1 (Ser1101) ? IRS-1 (Ser307) ? IRS-1 (Ser312) ? IRS-1 (Ser323) ? IRS-1 (Ser612) ? IRS-1 (Ser636) ? IRS-1 (Ser639) ? IRS-1 (Ser794) ? JAK1 (Tyr1022) ? LYN (Tyr507) ? MDM2 (Ser166) ? mTOR (Ser2448) ? mTOR (Ser2481) ? mTOR (Thr2446) ? p21Cip1 (Thr145) ? p27Kip1 (Ser10) ? p27Kip1 (Thr187) ? p53 (Ser15) ? p53 (Ser20) ? p53 (Ser315) ? p53 (Ser33) ? p53 (Ser366) ? p53 (Ser37) ? p70S6K (Thr229) ? p70S6K (Thr389) ? p70S6K (Thr421) ? p70S6K- (Ser423) ? Paxillin (Tyr118) ? Paxillin (Tyr31) ? PDK1 (Ser241) ? PI3K (Tyr607) ? PI3K / (Tyr467/Tyr199) ? PIP5K (Ser307) ? PP2A-a (Tyr307) ? PTEN (Ser370) ? PTEN (Ser380) ? PTEN (Ser380/Thr382/Thr383) ? RapGEF1 (Tyr504) ? RPS6(Ser235) ? SYK (Tyr323) ? SYK (Tyr348) ? SYK (Tyr525) ? SYN1-Synapsin1 (Ser62) ? Tuberin/TSC2 (Ser939) ? Tuberin/TSC2 (Thr1462) ? WEE1 (Ser642) ? XIAP (Ser87) 相关文献： 1. Jia D, et al.Amplification of MPZL1/PZR promotes tumor cell migration through Src-mediated phosphorylation of cortactin in hepatocellular carcinoma.Cell Res, 2014, (24):204-217. (上海仁济医院) 2. Ding Y, et al. Seed-targeting anti-miR-21 inhibiting malignant progression of retinoblastoma and analysis of their phosphorylation signaling pathways.Exp Eye Res,2014. (暨南大学) 3. Dong S, et al. The REG Proteasome Regulates Hepatic Lipid Metabolism through Inhibition of Autophagy. Cell Metab, 2013, 18(3): 380-391. （华东师范大学） 4. Li L et al. REG deficiency promotes premature aging via the casein kinase 1 pathway.Proc Natl Acad Sci USA. 2013; June 13. （华东师范大学） 5. Jin L et al. p90 RSK2 Mediates Antianoikis Signals by both Transcription-Dependent and -Independent Mechanisms. Mo Cell Biology. 2013; 33(13): 2574-2585. 6. Iwata J et al. Noncanonical Transforming Growth Factor (TGF) Signaling in Cranial Neural Crest Cells Causes Tongue Muscle Developmental Defects. J. Biol Chem. 2013; 288: 29760-29770. 7. Izzotti A et al. Relationships between pulmonary microRNA and proteome profiles, systemic cytogenetic damage, and lung tumors in cigarette smoke-exposed mice treated with chemopreventive agents. Carcinogenesis. 2013; May 24. 8. Xu N et al. Activation of RAW264.7 mouse macrophage cells in vitro through treatment with recombinant ricin toxin-binding subunit B: Involvement of protein tyrosine, NF-B and JAK-STAT kinase signaling pathways. Int J Mol Med. 2013; 32(3): 729-735. （吉林大学） 9. Li F et al. Superoxide Mediates Direct Current Electric Field-Induced Directional Migration of Glioma Cells through the Activation of AKT and ERK. PLoS ONE. 2013; 8(4): e61195. （第三军医大学） 10. Cui WY et al. Identification and Characterization of Poly(I:C)-induced Molecular Responses Attenuated by Nicotine in Mouse Macrophages. Mol Pharmacol. 2013; 83:61-72. （浙江大学） 11. Shin D. M., et al. Chemoprevention of head and neck cancer by simultaneous blocking of epidermal growth factor receptor and cyclooxygenase-2 signaling pathways: preclinical and clinical studies. Clin Cancer Res. 2013; 19(5): 1244-1256. 12. Eke I et al. EGFR/JIP-4/JNK2 signaling attenuates Cetuximab-mediated radiosensitization of squamous cell carcinoma cells. Cancer Research. 2013; 73(1):297-306. 13. Fan H et al. Cardioprotective Effects of Salvianolic Acid A on Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury In Vivo and In Vitro. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 508938. （烟台大学） 14. Zhang YM et al. A novel angiogenesis inhibitor impairs lovo cell survival via targeting against human VEGFR and its signaling pathway of phosphorylation. Cell Death Dis. 2012; 3: e406. （西安交通大学） 15. Sacc SC et al. New proteins as vascular biomarkers in primary open angle glaucomatous aqueous humor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2012; 28, 53(7):4242-53. 16. Makishima H et al. CBL mutation-related patterns of phosphorylation and sensitivity to tyrosine kinase inhibitors. Leukemia. 2012; 26(7):1547-54. 17. Bernier M et al. Negative regulation of STAT3 protein-mediated cellular respiration by SIRT1 protein.J Biol Chem. 2011; 286(22): 19270-19279. 18. Yu Y et al. Cellular Iron Depletion Stimulates the JNK and p38 MAPK Signaling Transduction Pathways, Dissociation of ASK1-Thioredoxin, and Activation of ASK1. J Biol Chem, 2011; 286: 15413-15427. 19. Hu Y, Pioli P D, Siegel E, et al. EFEMP1 suppresses malignant glioma growth and exerts its action within the tumor extracellular compartment. Mol Cancer, 2011, 10: 123. 20. Li Hui et al. Increased prevalence of regulatory T cells in the lung cancer microenvironment: a role of thymic stromal lymphopoietin. Cancer Immunology Immunotherapy. 2011; 60(11): 1587-1596. （天津医科大学） 21. Izzotti A et al. Proteome Alterations in Primary Open Angle Glaucoma Aqueous Humor. J Proteome Res. 2010; 9 (9): 4831-4838. PI3K/Akt/mTOR 信号通路 关键词： 信号通路 抑制剂 细胞 2012-07-17 00:00 来源：互联网 点击次数：3767 目的：通过特异性阻断 PI3K 和 mTOR，观察 HepG2 和 Hep3B 细胞株 PI3K/Akt/mTOR 信 号通路活性及生物学行为的改变，探讨相关的分子机制。 方法：在培养的 HepG2、Hep3B 人肝癌细胞株和人正常肝细胞株 QSG-7701 上，以免疫印 迹方法（Western blot）检测各细胞株中 PI3K（p110 亚单位） 、 PTEN、pAkt（S473，T308）和 p-mTOR（S2448）的表达情况；分别用 PI3K 抑制剂 LY294002（50mol/ml）和 mTOR 抑制剂 Rapamycin（RAPA，50 nmol/ml）孵育 HepG2 和 Hep3B 细胞，以 MTT 比色法检测细胞的增殖能力，以流式细胞术（Flow cytometry）检 测细胞周期和凋亡情况，以 Western blot 法检测细胞中 pAkt（S473，T308）和 p- mTOR（S2448）的表达改变。 结果：PTEN 在 HepG2 和 Hep3B 细胞中基本无表达，在 QSG-7701 细胞株中高表达，pAkt 和 p-mTOR 在 HepG2 和 Hep3B 细胞中的 表达较 QSG-7701 细胞均显著升高；LY294002 和 RAPA 均呈剂量- 时间依赖的抑制 HepG2 和 Hep3B 细胞生长。饱和效应浓度的 LY294002 和 RAPA 作用 24 小时后，HepG2 和 Hep3B 细胞均呈现明显的 G0/G1 期阻滞， 处于 S 期的细胞比例较对照组显著减少 （P0.01） ；两给药组中 HepG2 细胞和 Hep3B 细 胞的凋亡率与对照组比较均显著增加（P0.01） ；两给药组 HepG2 细胞的凋 亡率显著高于 Hep3B 细胞（P0.01 或 P0.05） ，并且 HepG2 细胞的凋亡率在 RAPA 给药组显著高于 LY294002 给药组 （P0.01） ，但 Hep3B 细胞的凋亡率在两组间无显著差异。饱和效应浓 度的 LY294002 作用 48 小时后， HepG2 和 Hep3B 细胞中 pAkt（T308，S473）和 p- mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P0.01） ，饱和效应浓度的 RAPA 作用 48 小时 后，HepG2 和 Hep3B 细胞中 P-mTOR（S2448 ）的表达水平较对照组均显著降低 （P0.01） ，而 pAkt（T308，S473）的 表达水平较对照组均显著升高（分别 P0.01） 。 结论：（1）HepG2 和 Hep3B 细胞存在 PI3K/Akt/mTOR 信号通路的组成性激活；（2） LY294002 和 RAPA 能有效阻断 HepG2 和 Hep3B 细胞 PI3K/Akt/mTOR 信号通路，抑制 HCC 细胞的生长增殖，诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，且阻断效应与 HCC 细胞 P53 22. Kang S et al. p90 ribosomal S6 kinase 2 promotes invasion and metastasis of human head and neck squamous cell carcinoma. J Clin Invest 的表达有 关；（3）一定浓度范围内， HepG2 细胞对 PI3K/Akt/mTOR 信号通路阻断剂的 敏感性高于 Hep3B 细胞，RAPA 对 PI3K/Akt /mTOR 信号通路的部分阻断效应优于 LY294002。 目的：观察阿霉素（Doxorubicin，DOX）单用或与 RAPA 联合用药对 HepG2 和 Hep3B 细 胞生物学行为及 PI3K/Akt/mTOR 信号通路活性的影响，探讨 mTOR 抑制剂增强 HCC 化疗 药物疗效的相关作用机制。 方法：分别取对数生长期的 HepG2 和 Hep3B 细胞，以不同浓度的 DOX 单用或与 RAPA（ 20 nmol/ml）联合应用培养 48h 或 24h，以 MTT 法测定药物对 HepG2 和 Hep3B 细 胞的增殖抑制作用，以流式细胞技术检测二者的凋亡情况，以 Western blot 法检测者 P- p70S6K（T389） 、P-4E-BP1 （S65 ）和 pS6（S235/236）的表达改变。 结果：0.1562.5 mg/L 浓度范围内，DOX 能抑制 HepG2 和 Hep3B 细胞的增殖，且呈浓度 依赖性；DOX 在 0.62510mg/L 浓度范围内，Hep3B 细胞的相 对存活率显著大于 HepG2 细胞（P0.01） ；与 DOX 单用比较，DOX（0.1562.5mg/L）与 RAPA 联用显著降低了 HepG2 和 Hep3B 细胞的存活率（ P0.01 或 P0.05） ，DOX（0.15610mg/L ）与 RAPA 联 用，Hep3B 细胞存活率显著大于 HepG2 细胞（P0.01） 。DOX （0.15610mg/L）单用或 与 RAPA 联用 24h 均可诱导 HepG2 和 Hep3B 细胞凋亡发生，且 随 DOX 浓度增加，凋亡 牢升高；与 DOX 单用比较，DOX（1.2510mg/L）与 RAPA 联用，HepG2 细胞捌亡率较 显著升高 （P0.01 或 P0.05） ，DOX（2.510 mg/L）与 RAPA 联用，Hep3B 细胞凋亡率 显著升高（分别 P0.05） ；DOX（5.010mg/L）单用，HepG2 细胞凋亡率显著大 于 Hep3B 细胞（分别 P0.05） ，DOX（2.510 mg/L）与 RAPA 联用，HepG2 细胞凋亡率显 著大于 Hep3B 细胞（分别 P0.01） 。RAPA（20nmol/L） 、 DOX（2.5mg /L）以及二者联用 均可导致 HepG2 或 Hep3B 细胞 P-p70S6K（T389） 、P-4E-BP1（S65）和 pS6（S235/236 ） 表达减 少，且以 DOX 与 RAPA 联用效应最为明显。 结论：（1）DOX 可抑制 HepG2 和 Hep3B 细胞生长增殖，促进细胞凋亡，下调 PI3K/Akt/mTOR 信号通路的活化程度；（ 2）DOX 与 RAPA 联合用药能显著抑制 HepG2 和 Hep3B 细胞的增殖，促进细胞凋亡，下调 PI3K/Akt/mTOR 信号通路的活化程度，并在 一定浓度范围内表 现出协同效应；（3）在一定浓度范围内，HepG2 细胞对 DOX 单用或 与 RAPA 联合用药的敏感性显著高于