4.护骨胶囊对成骨细胞增殖、分化影响

第 15 卷 第 10 期 辽宁中医药大学学报 Vol.15 No.10 2013 年 10 月 JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM Oct.,2013 护骨胶囊对成骨细胞增殖、分化影响 李宝红 1， 吴劲东 2， 赵文昌 1， 宋丽军 1 (1.广东医学院药学院 广东 东莞 523808；广东医学院药理学教研室，广东 东莞 523808) 摘要：目的：探讨护骨胶囊对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。方法：采用多次 酶消化法分离出大鼠颅盖骨的成骨细胞,采用 MTT 法和碱性磷酸酶法分别检测护骨胶囊对成骨 细胞增殖和分化的作用;采用 SYBR green I 嵌合的 RT-PCR 方法检测 Runx2 mRNA 表达 水平。结果：护骨胶囊在浓度 0.0252.5g/mL对成骨细胞有促增殖的作用 ,护骨胶囊在浓 度 0.02525g/mL对碱性磷酸酶的活性均有提高的作用,护骨胶囊在浓度 25g/mL下, 对 Runx2 mRNA 水平有上调的作用。结论：护骨胶囊对成骨细胞有促增殖、促分化的作用, 可 能与上调 Runx2 mRNA 水平有关。 关键词：护骨胶囊；成骨细胞；碱性磷酸酶；Runx2 中图分类号：R283 文献标志码：A 文章编号：1673-842X（2013）10-0024-03 Effect of Capsule on Proliferation and Differentiation of Primary Osteoblasts in Vitro LI Baohong ,WU Jindong ,ZHAO Wenchang ,SONG Ljiun1211 (1.College of Pharmacy, Guangdong Medical College,Dongguan 523808,Guangdong China; 2.Department of Pharmacology, Guangdong Medical College,Dongguan523808 Guangdong,China) Abstract:Objective:To investigate the effect of Hugu Capsule on proliferation and differentiati on in primary osteoblasts.Methods:Bone cells were obtained by enzyme digestion from the segregated neonatal SD rat skull.The effects of Hugu Capsule on the proliferation and differentiation of rat osteoblasts were evaluated by the MTT method,measuring the avtivity of alkaline phosphatase, respectively.Runx2 expression was analyzed by real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) using SYBA Green I. Results:With the concentration of 0.025-2.5g/mL,Hugu Capsule had significant effect on the ROBs proliferation. The ALP activity was significantly increased at the concentration from 0.025g/mL to 25g/mL. With the concentration of 25g/mL,Hugu Capsule can increase th e Runx2 Mrna level.Conclusions:Hugu Capsule can stimulate the proliferation and differentiati 十五卷 辽宁中医药大学学报 on of osteoblasts in vitro, and the reason may be connected with the up regulation of Runx2 mRNA level. Key words:Hugu Capsule; osteoblasts; alkaline phosphate;Runx2 护骨胶囊是由淫羊藿、制何首乌、巴戟天、骨碎补、龟甲、山药、熟地黄、当归、杜仲、 续断等组成的中药复方新药，临床试验表明其具有较好的治疗原发性骨质疏松症和绝经后 骨质疏松症的作用 1-2。但目前对其抗骨质疏松的作用机制尚未进行深入研究，本项目通过 探讨护骨胶囊对大鼠原代成骨细胞增殖分化的影响，并进而分析其调控骨形成过程中转录 因子 Runx2 mRNA 的表达水平，为护骨胶囊治疗骨质疏松症提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料及试剂 护骨胶囊干膏粉，由东莞万成制药有限公司提供，临用前用 DMEM 配制成所需药物 浓度；新生 SPF 级大鼠，1龄，购自广东医学院实验动物中心，动物合格证号： SYXK（粤） 2008-0008；DMEM 培养基，Gibco 公司；胎牛血清，hyclone 公司；碱性磷酸 酶试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供；逆转录试剂盒和 real time-PCR 试剂盒，由大 连 Takara 公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。 1.2 主要仪器 ABI 7500 Real Time PCR 扩增仪，美国 ABI 公司；Nanodrop 1000 核酸蛋白微量定量 仪，美国 Nanodrop 公司；5417R 型高速台式离心机，德国 Eppendrorf 公司；微型离心机， 德国 Eppendorf 公司；PCR 扩增仪，美国 Applied Biosystems 公司；酶标仪，美国 BioTek 公司。 1.3 方法 1.3.1 成骨细胞的分离 取新生的 SD 大鼠约 10 只，脱臼处死后投入盛有 75%乙醇的容器内消毒 5min，取出 置于消毒培养皿中。无菌条件下剪去头顶部皮肤，取出颅盖骨，然后放入盛有 PBS 缓冲液 （含 100U/mL 青霉素和 100mg/L 链霉素）的培养皿中，清除骨膜、血管等结缔组织，用 PBS 缓冲清洗 2 次后将洗净的颅盖骨剪成 1mn 小片。移入 0.25%胰蛋白酶溶液中，373 下预消化 20min，以消除纤维组织。消化 6 个循环，每个循环 20min，前 2 次循环去掉沉 淀，后 4 次循环取沉淀，1000r/min 离心 10min，细胞以适当的密度接种到培养瓶中，放入 辽宁中医药学报 十五卷 37，5%CO 培养箱中培养，次日换液，以后每隔 2d 换液 1 次，待细胞融合 80%左右后，2 用胰蛋白酶进行消化传代，本次实验所采用的是 3 代或 4 代细胞。每项实验重复 3 次 。 1.3.2 成骨细胞鉴定 取 3 代或 4 代细胞，接种于 6 孔板中，待细胞生长贴壁后，去掉培养基，用 42.5% 戊二醛冷固定 10min，然后按照 BCIP/NBT 试剂盒进行染色操作，倒置显微镜下观察。 1.3.3 细胞增殖实验 取 3 代或 4 代成骨细胞，用 0.25%胰酶消化制成细胞悬液，以每孔 310 /mL 接种于4 96 孔板中，每孔 100L，同时设置空白调零孔。细胞常规培养 24h 后，换入不同浓度的 护骨胶囊溶液，于规定的时间点进行检测，加入不含血清的培养基 100L，同时加入 10L 的 0.5%MTT，孵育 4h 后，去掉培养基，加入 100LDMSO，振摇至结晶完全溶解 后，用酶标仪在 490nm 处检测其 OD 值。 1.3.4 碱性磷酸酶实验 24 孔板中每孔接种 410 /mL 细胞，培养 24h 后，加入不同浓度的护骨胶囊溶液， 隔天换液，培养 7d 后，先用 PBS 清洗 2 遍，吸干后加入 250L 蒸馏水，反复冻融 2 次并 超声后，按碱性磷酸酶试剂盒进行后续操作。 1.3.5 RTqPCR 实验 于给药 7d 后，提取总 RNA，检测 Runx2 mRNA 表达水平。所用引物根据 GeneBank database 所发布的序列设计并合成，总 RNA 的提取采用 Trizol 一步法进行，核酸蛋白微量 定量仪检测纯度并计算浓度，然后取一定量的总 RNA 将其逆转录为 cDNA。逆转录体系、 PCR 扩增体系及反应条件均参照说明书设定。反转录反应后，采用实时 SYBR green I 嵌合 方法检测 RTPCR（荧光定量）。根据 Ct 值比较基因的表达量，各目的基因表达水平差 异的比较采用“变化倍率=2 ” 计算 。见表 1。Ct4 十五卷 辽宁中医药大学学报 1.4 统计学处理方法 所有实验数据采用 SPSS13.0 统计软件进行统计分析，计量资料数据以均数标准差（ s）表示。多个样品均数比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA），如方差齐x 性，则组间两两比较采用 SNK 法，方差不齐采用 Dunnetts T3 法，P0.05），表明护骨胶囊在浓度 0.0252.5g/mL 内对成骨细胞有一定的增殖 作用。阳性药物 NaF 组，与空白组比较，差别有统计学意义（P0.05）。药物组在浓度 25g/mL，与阳性药物组比较，差别有 统计学意义（P0.05 ），说明药物组和阳性组对碱性磷酸酶活性的影响相当。 2.4 RTqPCR 实验 表 3 SYBR green I RTPCR 检测成骨细胞 Runx2 基因的 mRNA 表达水平（n=3， s）x 注：与空白组比较，*P0.05），表明护骨胶囊对成骨细胞 Runx2 基因的 mRNA 表达水平有一定的上调作用。阳性药物组 NaF 在浓度 10 mol/L,与空6 白组比较，差别无统计学意义（P0.05）。药物组在浓度 0.2525g/mL 内，与阳性药物 辽宁中医药学报 十五卷 组比较，差别无统计学意义（P0.05）。药物组浓度在 0.025g/mL ，与阳性药物组比较， 差别有统计学意义（P0.05）。 3 讨论 骨质疏松是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发 生骨折的一种全身性骨骼疾病，是骨代谢失衡的结果。而成骨细胞在其中扮演着重要的角 色，它不仅决定骨形成，同时也调节破骨细胞的骨吸收，是骨代谢的重要功能细胞。成骨 细胞的增殖与分化受到抑制，从而使骨质量和骨量下降，骨小梁稀疏、断裂，是导致骨质 疏松的病理机制之一，因此防治骨质疏松与提高成骨细胞的增殖和分化水平密不可分。 ALP 是成骨细胞分化的特异性标志之一，骨形成时成骨细胞可分泌大量的 ALP 参与骨的矿 化，因此 ALP 活性可以反映成骨细胞的活性状况。我们通过本实验发现，护骨胶囊在一定 的浓度范围内对成骨细胞有促增殖和促分化的作用。单促分化的作用并不成剂量依赖性的 关系，这可能与中药的治疗多靶点的作用相关，而近些年来也发现 Runx2 是成骨细胞特异 性转录因子 ，在成骨细胞的分化成熟以及骨形成中起着关键性的作用，而护骨胶囊对65 其有上调的作用，在某种程度上可以说明护骨胶囊可能通过上调 Runx2 基因的 mRNA 表 达水平发挥促分化的作用，其更深层次的调控机制仍有待进一步研究。 参考文献 1洪曼杰，卢丽，王晓东，等.中药复方护骨胶囊治疗原发性骨质疏松症的临床研究 J.中 国骨质疏松杂志，2008,14（12）：891-895. 2王晓东，邓伟民，洪曼杰，等.护骨胶囊治疗绝经后骨质疏松症的临床研究 J.实用医学 杂志，2011,27（9）：16621664. 3刘钰瑜，崔燎，吴铁，等.大黄素对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的影响 J.中国药理 学通报，2005,21（2）：235-240. 4Liva K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and 2 methodJ.Methods，2001，25:402 408ct 5Coffman J A.Runx transcriptio