gdnf基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

GDNF 因子受体在脑神经修复 临床应用中的研究 本文作者 武玉华 徐刚 （作者单位系：中华脑病康复医学会常务委员、 脑神经医学研究 杂志编委、北京高科医院脑瘫专家诊室主任、副主任） 【内容摘要】 研究背景：脑外源性神经因子(GDNF)对多巴胺(dopamine,DA)、 酪 氨酸激酶 (RET)等大脑神经元有特异营养作用, 可促进 DA、RET 等 大脑发育重要神经元营养吸取、修复、激活、增殖和分化，是目前 防治脑瘫病 (Cerebral palsy disease)最有前途的神经营养因子 。 研究目的：建立脑外源性神经因子(GDNF)对大脑受损神经细胞修复 机制，有效恢复脑发育功能。 研究方法：将 GDNF 因子以 FuGENEHD 转染试剂介入染鼠脑神经细胞， 鉴定其分化能力。 研究结果：免疫细胞化学及 westernblot 表明，GDNF 因子能正确修 复染鼠受损脑神经细胞，并增殖与分化，重塑。 研究价值：建立 GDNF 因子介入脑神经细胞修复激活机制，对进一步 开展人脑受损神经治疗，健全神经组织，恢复脑瘫患者思维功能、 语言功能、认知功能、行为功能、运动功能等具有重要价值。 【关键词】 GDNF 因子介入 脑受损神经修复 脑瘫病防治 研究 GDNF 生物基因治疗是目前解决给药和开刀治疗脑瘫问题最有 希望的方案。多巴胺(dopamine,DA)、 酪氨酸激酶 (RET)等神经细 胞作为神经组织特异性的重要前体细胞, 已广泛应用于中枢神经系 统疾病的细胞和基因治疗。大脑 NSCs(midbrainderivedneuralstemcells, mNSCs)具有发育分化为 DA 能 神经元的倾向, 更适用于临床介导治疗脑瘫病 (Cerebral palsy disease) 。本研究选取外源性脑神经因子(GDNF) 外源性 , 以聚合酶链式扩增 相结合技术 RT-PCR 进行 GDNF 基因克隆, 介导转染鼠脑试验，为 进一步应用其研究治疗脑瘫病 (Cerebral palsy disease)提供依据。 一、研究过程 1.大鼠脑神经细胞多巴胺(dopamine,DA)、 酪氨酸激酶 (RET)的 分离培养与鉴定。 无菌解剖分离大鼠侧中脑, 分离制备多巴胺(dopamine,DA)、 酪 氨酸激酶 (RET)单细胞悬液。以 2 105 个/ml 的密度完全培养液 (DMEM/F12、1% N2 、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF)、37 5% CO2 培养, 3 4d 半量换液, 5 7d 以 1 105 个/ml 的密度传代。取 第 3 代神经球进行 Nestin(Abcam)免疫细胞化学鉴定。 2GDNF 因子修复鼠神经元机制的建立 转染前 1d 离心收集第 3 代神经球, 分离制备单细胞悬液, 106 个/孔(2ml)接种 6 孔板, 37 5% CO2 培养 18 24h。取质粒 pEGFPN1-GDNF 2g、FuGENE HD 转染试剂(Roche)6l 加入 100lOpti-MEM I 低血清培养基 (Ivitrogen)中, 充分混匀后室温静置 15min 形成转染复合物 , 将其均匀滴加于神经细胞培养基中, 轻轻晃 动培养板使之混合均匀。37 5%CO2 培养 72h 后以 1 105 个/ml 的密度传代, 更换含有 G418(100g/ml, Ivitrogen)的神经细胞培养液 进行筛选，荧光显微镜下观察 EGFP 的表达情况。 北京高科医院 3、神经细胞修复免疫细胞化学鉴定。 常规提取总蛋白各 60g 进行 15%SDS-PAGE, 电泳结束取出 凝胶, 用转印仪将蛋白转移在硝化纤维膜上。转移膜经 5%脱脂奶粉 封闭后, 分别与兔抗 GDNF 多抗(Abcam) 、HRP 标记的山羊抗兔 IgG(北京中杉金桥 )孵育, 然后与 LumiGLO 化学发光底物(KPL) 孵育 后 X 光片直接曝光。以神经细胞分化培养液 (DMEM/F12、1%N2 、1% 胎牛血清 )重悬,接种于预先放置多聚赖氨酸包被盖玻片的培养 板中, 37 5%CO2 培养 7d 后进行 -III-Tubulin、TH 、GFAP 和 GDNF(Abcam)免疫细胞化学鉴定。设置转染质粒 pEGFPN1 和不转 染基因的细胞，为阴性对照。 二、研究结果分析 GDNF 基因修复鼠脑神经细胞机制建立后 12h 可观察到脑神经 网络发育逐渐健全。 GDNF 基因修饰 mNSCs 的诱导分化 GDNF 基因修饰 mNPCs 体外诱导分化 7d 后免疫细胞化学染色显示细胞可分化为 -III- tubulin 免疫阳性的神经元、TH 免疫阳性的 DA 能神经元和 GFAP 免疫阳性的星形胶质细胞, 分化后细胞仍然表达 GDNF 及 EGFP。 多巴胺(dopamine,DA)、酪氨酸激酶 (RET)明显增加，在吸取、 修复、激活、增殖和分化中正常生长。3 分钟后 EGFP 阳性细胞激 活、再生, 5 小时细胞克隆增大形成神经球， 10 分钟后达到顶峰。 pMD19-GDNF 经 HindIII、BamH I 双酶切后, 可见 652bp 和 2.7kb 两 条带, 与预期结果一致。一周后，免疫细胞化学染色显示细胞呈 Nestin、GDNF 免疫阳性， westernblot 显示 GDNF 基因转染组 GDNF 高表达 , 而阴性对照组则为 GDNF 低表达，脑发育功能恢复 正常。 三、临床应用价值思考 GDNF 对多巴胺 (dopamine,DA)、 酪氨酸激酶 (RET)等神经元 有特异性营养作用, 是目前防治脑瘫病 (Cerebral palsy disease)最有 前途的神经营养因子。本研究建立的 GDNF 基因能使染鼠脑受损神 经细胞在分化培养液的作用下诱导分化成神经元和胶质细胞, 证明 其有修复、存活、分化、增殖、更新、再生等多向潜能，是中枢神 经系统基因治疗的理想载体。如将此法应用于脑瘫临床，对思维、 语言、认知、行为、运动等功能障碍可取得满意疗效，为从解除病 理根源上治疗脑瘫带来新的希望。 参考文献 1、陈宁新生儿缺氧缺血性脑病血和脑脊液中 Epo、Lac 变化及临 床意义 中国医科大学 2002 年 2、