免疫标记在肿瘤中应用

肿瘤病理诊断新技术 一、 免疫组化技术 免疫组化技术现已广泛应用于病理诊断，不仅在解决疑难病例诊断方面起着重要作用， 随着人们医疗风险意识的增强，许多普通的病例也常常需要免疫组化进一步证实，因此成 为病理科医生常规工作中不可缺少的重要工作、常规手段。 在小活检病理检查中免疫组化技术能明确地显示癌细胞的存在（如胃粘膜活检中的印 戒细胞癌） ，可使微小癌、微小转移灶（淋巴结及骨髓） 、甚至不易察觉的病变得以确诊。 通过乳腺癌激素受体（ER、 PR）的检测，免疫组化技术在指导临床治疗方面已起到了 重要的作用。通过检测针对肿瘤基因产物（C-erbB2、P53、ALK、CD117 等）的抗体还将 进一步为分子靶向治疗提供重要的参考依据。细胞增殖核抗原（Ki-67）等免疫组化染色可 为肿瘤的预后提供依据。 免疫组化技术的局限性：至今无绝对特异的抗体！相当多的肿瘤缺乏特异的抗原表达； 同一种抗原常常可在多种肿瘤中表达，不少肿瘤又由于分化太差或细胞分子结构改变而不 表达相关的抗原。不同抗体滴度有不同的阳性结果；内源性生物素造成假阳性，如肝细胞 癌等；缺乏免疫组化的标准化（同一实验室及不同实验室间结果的一致性） ；定量结果的判 断等还存在不少的问题尚待解决，如 ER 受体，有的实验室只要有阳性肿瘤细胞就视为阳 性，而有的实验室则要至少 20细胞阳性才视为阳性，阳性标准往往是随意确定的，未经 临床病理研究证实。 如何正确应用免疫组化呢? 要得到正确、有价值的免疫组化结果，免疫组化实验室规 范、合适的技术操作（包括组织固定、抗原修复、检测系统、各类试剂的质量保证、染色 技术等）是最重要的基础保证，但病理科医生在组织块的选择、抗体的选择、结果的判断 等方面也起着不容忽视的作用。 二 分子病理学 这是继电镜、免疫组化之后的第三个浪潮。其优点是反应特异、敏感，检测靶信号 本质上不同，DNA 检测温度固定影响小。采用的方法包括 PCR、滤膜杂交（斑点、印迹 转移） ，原位杂交、荧光原位杂交（FISH） 、显微切割技术、比较基因组杂交、生物芯片 （基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片）等。 分子病理学检测内容包括肿瘤基因(癌基因、抑癌基因/原癌基因)、点突变、染色体重 排（易位、倒转过表达/新的杂合基因） 、基因扩增和缺失等。分子病理学检测为肿瘤定 性、分类、预后判断可起到重要的帮助。 显微切割技术是 90 年代出现的一项新技术，这项技术对肿瘤、细胞生物学及分子生物 学研究有巨大的推动作用。该技术能够在显微镜下，从组织切片上切下小片组织或单个细 胞，用这些切下的材料进行 PCR 扩增，能够得到同类细胞，甚至单个细胞的基因，这样研 究结果更为准确。 组织芯片又称组织微阵列（tissue microarray）, 是 1998 年在 cDNA 微阵列的基础上发 明的一种特殊的生物芯片，是继基因芯片和蛋白芯片之后生物芯片家族的又一新成员。 组织芯片的原理是根据不同需要，利用特殊的仪器，将多个（病例）小组织片高密度 的、整齐的排列固定在某一固相载体上（载玻片、硅片、聚丙烯或尼龙膜等） ，而制成微缩 的组织切片。其最大潜在作用是将基因、蛋白水平的研究与组织形态学相结合，使应用同 一实验指标，同时快速研究大量不同组织样本（高通量、多样本）的设想成为现实，减少 了实验误差，几十倍、上百倍的提高组织病理学研究的效率，节约实验材料和试剂，同时 使实验结果有更可靠的可比性；对于原始病理资料的保存和大量样本的回顾性研究具重要 的意义。 组织芯片的应用范围：研究目的基因在不同病变（肿瘤）间的表达差异；寻找疾病新 基因，疾病（肿瘤）中新基因、突变体与基因多态性的检测，药物的筛选；疾病的病理诊 断；质量控制等。 原位杂交是在一定的生物结构基础之上的核酸杂交，这种结构基础可以是一条染色体、 一个细菌、更大的结构基础是细胞和组织。故此杂交的共同点是有明确的结 构基础，可反映基因杂交的准确部位。 免疫组化技术在肿瘤病理诊断中的应用 一、免疫组织化学的工作原理 1、 已知的特异性抗体或抗原能特异性结合 通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶，金 属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色） 借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确定组 织、细胞结构二、应用范围： (1)提高病理诊断准确性 (2)对疾病的预后和治疗的意义 (3)对肿瘤增生程度的评价 (4)微小病灶的发现 微小癌，微小病灶（如羊水栓塞） (5)指导肿瘤的治疗 (6)恶性淋巴瘤及白血病的诊断及分型 (7)病原微生物的检测 1 上皮性肿瘤标记物 (1)共同的标记物 角蛋白*(cytokeratin/keratin, CK/KER) *共有 20 种亚型，高分子量角蛋白见于复层鳞状上皮，低分子量角蛋白见于腺上皮。 桥粒蛋白*(desmoplankin) *分布于上皮细胞间的连接部位，是一种很好的上皮细胞标记，此外，凡有细胞连接的 非上皮细胞也可以表达，如脑膜瘤、尤文肉瘤、颗粒细胞瘤、精原细胞瘤。 (2)存在于大部分上皮细胞内的标记物 上皮膜抗原(epithelial membranous antigen, EMA)*大多数上皮性肿瘤，常与角蛋白 联合应用 *腺上皮性肿瘤，浆细胞瘤，大细胞淋巴瘤，浆细胞骨髓瘤，脑膜瘤均有表达。 (3)选择性存在于某些上皮细胞内的标记物 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)*是内胚层来源的上皮性肿瘤分化标记物， 见于腺癌及某些鳞癌，鉴别腺癌(+)与间皮瘤(-)。但血细胞来源的肿瘤(绿色瘤、髓细胞白 血病)、恶性纤维组织细胞瘤均呈阳性反应。 甲胎蛋白(-fetoprotein,AFP) 肝细胞癌，生殖细胞性肿瘤，如内胚窦瘤，睾丸胚胎 癌有交叉反应。 前列腺特异性抗原(prostatic specific antigen，PSA) 前列腺上皮及其来源的肿瘤， 也可从转移性肿瘤中鉴别出前列腺癌 结肠癌相关抗原(CA19-9) 胃肠道肿瘤，胰腺癌 卵巢癌抗原(CA125) 卵巢、子宫、乳腺癌 2 间叶源性肿瘤标记物 (1)间叶细胞及肿瘤共同标记物 波形蛋白*(vimentin, VIM) 间叶组织、良、恶性肿瘤 *缺乏特异性，配合其他更有鉴别力的标记物仍有价值。 (2)肌细胞，肌上皮及肿瘤标记物 结蛋白(desmin，DM) 肌细胞及其肿瘤(横纹肌肉瘤/平滑肌肉瘤) 肌红蛋白(myoglobin，MG) 横纹肌，心肌细胞及其肿瘤 肌球蛋白(myosin) 横纹肌特异性标记物，但不敏感 肌肉特异性肌动蛋白(ms-actin,MSA,CMA,HHF35) 平滑肌，横纹肌、肌上皮，肌纤维母 细胞 平滑肌肌动蛋白(SM-actin/SMA) 对平滑肌较特异 (3)内皮细胞及肿瘤标记物 第因子相关抗原(factor -related antigen, FRAg) 血管内皮细胞及其肿瘤 CD31 血管肉瘤 上皮样血管内皮瘤特异性较强 CD34 内皮细胞，血管良恶性肿瘤，kapposi 肉瘤 *胃肠道间质肿瘤 70%病例为 CD34 阳性 *100%病例 CD117 阳性 (4)组织细胞标记物 CD68(Kp-1) 全组织细胞标记物，如恶性纤维组织细胞瘤 无明确特异性 -抗糜蛋白酶(-antichymotrypsin AACT) 具有组织细胞分化的肿瘤，如恶纤组 -抗胰蛋白酶(-antitrypsin,AAT)* 组织细胞及其肿瘤 *肝细胞癌，具有肝细胞癌分化的生殖细胞肿瘤，如内胚窦瘤，亦标记胶质细胞瘤 溶菌酶(lysazyme，lys) 组织细胞及其肿瘤，其特异性不如 AAT 3. 淋巴造血组织标记物 (1) 共同标记物 白细胞共同抗原(leukocyte common antigen, LCA)CD45 全白细胞标记，血白细胞，单核细胞，肥大细胞，各种淋巴瘤；浆细胞及 R-S 细胞， 不表达 LCA (2) T 淋巴细胞标记物 CD45RO(UCHL-1)、CD3、CD43 (L60/Leu-27) T 细胞淋巴瘤 (3) B 淋巴细胞标记物 CD20(L26)、CDW75(LN1)、CD19 B 细胞淋巴瘤 (4) 霍奇金 R-S 细胞标记物 CD15+(Leu-M1)、CD30*(BerH2)+ 霍奇金淋巴瘤(非淋巴细胞为主型) CD20+、CDW75+、CD30-/+、CD15- EMA+ 霍奇金淋巴瘤(淋巴细胞为主型) *CD30 粒细胞、单核细胞、上皮细胞、R-S 细胞均有表达，某些未分化大细胞淋巴瘤(+) (5)组织细胞原性淋巴瘤标记物 CD68、MAC387、AAT、AACT + *CD 意为分化群(cluster of differentiation, CD)，是白细胞相关抗原的国际分类 系统，现已规定了 147 种白细胞抗原，由此也有相应抗体的命名。 4. 神经源性肿瘤标记物 (1)胶质细胞标记物 胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillory acidic protein, GFAP) 星形细胞瘤，各种胶质瘤，室管膜瘤，可与脑膜瘤鉴别 (2)少突细胞与雪旺细胞标记物 髓鞘碱性蛋白(MBP) 神经鞘瘤 S-100 蛋白* 神经鞘瘤，少突胶质细胞瘤，星形细胞瘤, 副节瘤 *S-100 还对黑痣、黑色素瘤、软骨性肿瘤、脂肪肿瘤呈阳性反应 (3)神经细胞及神经内分泌细胞标记 神经微丝(neurofilament, NF) 神经细胞及其肿瘤，如神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤 神经特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)*嗜铬粒(chromograninA,ChrA) 突触素(synaptophysin,syn) NSE 是神经内分泌肿瘤首选的标记物，而 NSE、chr、syn 三者均是 APUDoma 标记物， 见于嗜铬细胞瘤，副节瘤、PNET/尤文肉瘤、类癌、Merkel 细胞瘤、甲状腺髓样癌、肺小 细胞癌等。NSE 还与某些乳腺癌、大细胞淋巴瘤呈阳性反应。 (4)黑色素细胞标记物 人类黑色素瘤抗体 HMB45 S-100 蛋白 黑色素瘤和透明细胞肉瘤呈阳性反应，HMB45 特异性强，但不及 S-100 敏感。 5 内分泌肿瘤标记物 垂体激素 垂体细胞及其肿瘤，分泌性 APUD 肿瘤(“异位”激素) 促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素(GH)、泌乳素(LH)、促甲状腺激素(TSH) 甲状腺球蛋白(TGB) 甲状腺上皮肿瘤 降钙素(CT) 甲状腺髓样癌及 C 细胞增生 胰岛细胞相关激素及胃肠道激素 胰岛细胞瘤、胃肠道神经内分泌肿瘤 胰岛素(insulin)、胃泌素(gastrin)、生长抑素(somatostatin)、高血糖素(glucogen)、 胰多肽(pancreatic peptide)、蛙皮素(bombsin) 、小肠血管活性多肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)、P 物质 血清素(seratonin) APUD 肿瘤 睾丸酮 睾丸及卵巢性索间质肿瘤 人类绒毛膜促性腺激素(hCG)、人类胎盘泌乳素(hPL)： 滋养细胞肿瘤及具有滋养叶 成分的生殖细胞源性肿瘤 6 细胞外基质标记物 胶原蛋白(collagen) 型胶原 骨肉瘤 型胶原 软骨肉瘤 型胶原 纤维肉瘤 型胶原 基底膜特异性抗原，血管源性肿瘤 型胶原 广泛存在于全身 层粘蛋白(laminin, LN) 为基底膜连接蛋白，用于肿瘤浸润及转移机制研究 纤维连接蛋白(fibronectin FN) 作为间质肿瘤标记物，也用于肿瘤浸润转移研究 七、癌基因标记物 主要癌基因，其活化方式和相关人类肿瘤 四、举例说明 （一） 、肉瘤：Vimentin+ Cytokeratin- LCA- 1、恶黑：HMB45+，S-100+，Melon-A+， 2、肌源性肉瘤：HHF35（Actin）+，Desmin+ 3、平滑肌肉瘤：Actin(sm)+ 4、横纹肌肉瘤：Myoglobin+ ， Myosin+，MyD1+ 5、恶纤组：CD68+，Lysozyme+ 6、滑膜肉瘤：Cytokeratin+ 7、恶性间皮瘤：Calretinin+，Mesotheliol cell+ 8、原始神经外胚瘤：CD99+，Neuroblestoma+ 9、恶性神经鞘瘤，脂肪肉瘤：S-100+ 10、血管肉瘤：F8+，CD34+ ，CD31+ （二） 、淋巴瘤：LCA+，Vinentin，Cytokeratin- 1、CD20（B 细胞） 、CD3（T 细胞） 、LCA 为一线抗体； 2、有大的异型肿瘤细胞时 有大异型淋巴细胞时加 CD30+（何杰金细胞或间变大细胞淋巴瘤） 、ALK+（间变大细胞淋巴瘤） ； 有大异型上皮样细胞巢时，加 CK+（癌） 、HMB45+（恶黑） ； 伯基特淋巴瘤，Ki67 100%阳性。 3、有浆样分化 浆细胞肉瘤（CD20- ，CD3- 阴性）：用 、 链只有其中一种阳性； CD20 阳性，有浆样分化，诊断为浆样分化 B 细胞淋巴瘤。 4、主要是中小异型淋巴细胞 套区淋巴瘤：CD5+，Cyclin D1+，CD10-； 滤