受体分析检查检验核医学

受体的放射性配体结合分析 radioligand binding assay of receptors, RBA 1 v受体（receptor）是细胞膜上或细胞内的一些 能与生物活性物质相互作用并引起特异性生 物效应的物质。 v受体与其配体（ligand）结合后，通过受体特 定的信号传导系统，引起细胞的特定反应， 是高等动物适应环境、协调机体各种细胞功 能的关键性分子。 2 v受体的放射性配体结合分析（radioligand binding assay of receptors，RBA）是用放射 性核素标记的配体与相应的受体进行特异性 结合反应，从而对受体进行定性或定量分析 。 放射性配体 + 受体分子 受体配体 复合物 分离 B与F 测定，计算 受体数量及 亲和力 3 v定量RBA是在已知配体与受体反应的基础 上，通过结合反应得知一定数量的组织或细 胞与该放射性配体结合的受体数量，即结合 位点数。配体与受体的亲和力以结合反应的 平衡解离常数表示。 v定性RBA则通过反应量效关系、某些参数 的变化等判断受体的类型、结合方式（单位 点系统或多位点系统）、受体与配体相互作 用特点等。 4 一、RBA的主要优点 v1、高灵敏度 v2、特异性强、专一性好 v3、受体制剂的多用性 5 二、受体的分类 v膜受体 v核受体 6 （一）膜受体 v由胞膜外、胞膜内、跨膜区组成。按跨膜区又 可分为： v1、G蛋白偶联受体（神经递质、前列腺素等） v2、单一跨膜区有激酶活性受体（细胞因子） v3、单一跨膜区无激酶活性受体（生长因子、INS） v4、离子通道型受体（Na+、K+、Cl-、Ca+等） 7 8 v2、核受体 v受体在细胞核上，通过与细胞核内特定的DNA 结合后影响遗传信息的转录。核受体一般是 由4001,000个氨基酸残基组成的可溶性单 体蛋白质。氨基端是高度可变区，与转录的 特异性有关。中间是DNA结合区，富含半胱氨 酸，含有两个“锌指”结构，受体通过“锌 指”与DNA结合；该区域部位保守性强。羧基 端为激素结合区。 v糖皮质激素受体类、性激素受体类、甲状腺 激素受体类。 9 三、受体与其配基作用的特点 v1可饱和性 v2可逆性 v3、特异性和亲和力 v4生物效应的一致性 v5. 需具有内源性配体 10 v1可饱和性 v每个细胞所含的受体数目有限，故配体与受 体的结合反应具有可饱和性，呈高亲和力和 低容量。 v2、可逆性 v配体与受体的结合是可逆的，当受体周围配 体浓度降低，结合反应就逆向进行，即配体 与受体解离，解离后的配体是原形，不起代 谢变化。 11 v3、特异性和亲和力 v受体有特异识别配体的作用，只有严格构型 和构象的配体才能选择性地与某受体结合。 受体的特异性还表现在器官或组织的专一性 。受体的亲和力表明其与配体的结合能力， 高亲和力说明受体配体结合牢固。平衡解离 常数在10-9mol/L以上的被认为高亲和力受体 。 12 v4生物效应的一致性 v受体的主要功能是介导配体的生物效应，如 一种蛋白质与某种物质结合而不介导特定生 物效应，则此蛋白质不能称之为受体。 v5. 需具有内源性配体 v受体都需有内源性配体，如果通过外源性配 体发现某种蛋白质分子具有类似受体的特性 ，但未找到内源性配体，则称之为孤儿受体 ，不能认为是真正的受体。 13 四、单位点系统RBA的基本原理 v1、简单单位点系统受体配体相互作用的基 本规律 v 不少受体与配体结合的系统只存在一种结 合位点，即简单单位点系统，其基本规律符 合质量作用定律。 质量作用定律 14 1=1RL， 2=2RL 平衡时：1RL= 2RL 则平衡解离常数： KD=2/1=R.L/RL KD是平衡解离常数,为平衡亲和常数KA的 倒数，单位为mol/L，KD越大表示亲和 力越低。 15 设受体和配体的初始浓度为RT和 LT,R=RT-RL，L=LT-RL，则： v经整理后得： v RL2 RLRT + LT + KD + RTLT= 0 对特定配体和某一固定量的特定受体，RT 和KD均是定值，于是RL仅随LT而变， 二者呈双曲线函数关系。 16 v2、饱和曲线 v简单单位点系统RBA应能得到典型的饱和曲 线。以RL为纵坐标，LT为横坐标，得到 RL随LT变化的曲线。配体的浓度从零开 始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后 逐渐变慢，最后绝大部分受体都与配体结合 ，即受体饱和了。此就是饱和曲线。 v饱和曲线趋向水平则说明大部分受体已与配 体结合。 17 18 （1）总结合（total binding，TB） v受体与标记配体结合时，测量得到的放 射性还含有一部分（反应管壁吸附、杂 蛋白吸附、分离不完全等）未与受体结 合的标记配体的放射性，需将此部分减 去才能得到特异结合计数。 19 （2）非特异结合 （non-specific binding，NSB） v放射性配体除与受体特异性结合外，尚可与其他成 分结合，称之为NSB。主要来自杂蛋白、反应器壁 、分离材料的吸附等。特点是结合容量大而亲和力 小，不会出现饱和现象，结合量与所使用的配体量 呈线性关系。 v常做一系列平行管，条件与TB相同，多加200 1000倍非标记配体以取代标记配体与受体结合，测 得的即NSB。 20 （3）特异结合 （specific binding，SB） v受体与标记配体结合的放射性计数，无法直 接获得。常用相同浓度的TB减去NSB求得。 21 TB SB NSB 22 五、离体RBA的基本方法 制备待测受体的离体标本 加放射性配体温育一定时间 终止反应、分离结合与游离部分 测定结合部分的放射性 数据处理、求出有关参数 23 （一）基本试剂及制备 v1、受体样本 v2、放射标记配基 v3、非标记配基 24 1、待测受体标本的制备 v用于离体RBA的标本大体可分为组 织切片、完整细胞悬液、经初步分 离的细胞组分及经增溶或进一步纯 化的受体蛋白等。 25 v1）组织切片 v为保持受体活性，常用冷冻组织切片， 厚度550 m，将其贴于涂有明胶的玻 片上，在温育缓冲液中与标记配体进行 反应。反应后洗去游离部分。可刮下切 片测量其放射性活度，也可用放射自显 影或免疫组化研究受体分布。 26 v2）完整细胞悬液的制备 v血细胞可用通常分离血中有形成分的方法分离。 从 组织中分离细胞一般是用胶原酶处理组织，再将游 离的细胞分离出来。 v用完整细胞进行RBA的主要优点是可同时观察配体 与受体结合的情况和细胞的生物效应，得到的结果 更能反映受体的生理特性。此外，还可直接给出平 均每个细胞的受体数目。缺点是在处理过程中有时 可能导致细胞表面生理活性的改变。有时受体在细 胞中的含量很低，则需用较大量的细胞才能作一次 实验。 27 v3）细胞组分的分离 v组织匀浆多数RBA使用细胞组分进行分析。 其优点是：去除了大部分杂蛋白和内源性 配体，减少NSB或其他因素的干扰；受体 蛋白得到初步浓缩，受体制剂的富集可获得 可靠的实验结果。 28 组织匀浆 沉淀：完整细 胞、核受体 上清液 8003500g, 1015 min 沉淀：线粒 体，膜受体 上清液 10,000300,000g, 1015 min 沉淀：微 粒体 上清液： 浆受体 10,000300,000g, 1015 min 29 2、放射标记配基 1）高亲和力、高特异性 2）高稳定性 3）高比活度 4）高放化纯 30 3、非标记配基 v用来设立NSB，可以与标记配基同一物质， 也可不同，但必须与受体结合有高亲和力。 31 （二）温育条件 v1、缓冲液 v2、时间与温度 32 （三）分离 v分离的目的是将已形成的放射性复合物与游 离的放射性配体分开，测定其复合物放射性 。一旦分离，原有的反应平衡被破坏，因此 在分离过程中要使复合物的解离降低到最低 程度，低温和快速是最有效的措施。 v常用的分离方法有： v1、平衡透析法； v2、离心法 v3、过滤法 33 六、定量RBA的数据处理 v定量RBA主要是通过测得的样品的 数据及所用标记配体的量和比活度 ，通过数学模型进行运算，得出受 体的有关参数RT、KD等。 34 1、单点法 v仅取一个浓度点的标记配体，标记配体的量 可使受体饱和并略有剩余（过量）。 v该法操作简便，标本用量少，但只能给出受 体的最大结合位点数（RT），无法得了该配 体与受体的亲和力（KD）。 35 单点法RBA的数据处理 v(1)从实验所得到的总结合TB减去非特异性结 合NSB的平均放射性计数（cpm）得到特异 性结合RL的cpm。 v(2)根据仪器测量效率将RL的cpm换算成dpm, 用配体的比活度再换算成mol。 v(3)受体与配体的结合按1：1形成复合物，则 RL的mol即为受体结合位点的mol数。 36 v(4)另取一定量的样品测蛋白含量或细胞 数，即可算成一定量蛋白或一定细胞数 中RT的mol数,即为RT。 v(5)还可进一步将mol换算成分子数（1 mol=6.021023个分子），从而得到单位 细胞或单位蛋白的受体结合位点数。 37 此式中受体与配体为1：1关系，如受体与配 体以1：2关系形成复合物，则上式应被2除。 对于完整细胞，则按细胞数进行计算，以 mol/106细胞或受体位点数/106细胞表示。 38 例 v实验室进行外周血WBC的GCR分析，测得TB为 4500cpm，NSB为2500cpm，3H-Dex的SA为 1.851012Bq/mmol，蛋白量为1mg，液闪的 Eff=30% vSB=TB-NSB=4500-2500=2000cpm v2000/（0.3601.8510121）=60fmol/mg 39 v1mol=6.021023分子 v60fmol/mg= 6010-156.021023=3.61010受体/mg蛋白 若：WBC细胞数为7.5106个，则 RT=3.61010/ 7.5106=4800受体/细胞 40 2、多点法 v多点法实验可分简单单位点和双（多）位点 两部分。常用多点饱和曲线法：即每一受体 标本做68个标记配体浓度点（多位点所需 浓度点更多），标记配体的用量应覆盖受体 的饱和区和不饱和曲，以得到饱和曲线。 v数据处理是将数学模型直线化，再将测得数 据进行直线拟合，求出所需参数。计算机普 及后，人们用计算机进行曲线拟合，以减少 直线化带来的误差。 41 vScatchard作图 v简单单位点系统在Scatchard作图中应呈一条 直线。 v以RL/L对RL作图，即为Scatchard作图 。在简单单位点系统，应得一直线。斜率是 -1/KD，而直线与横轴的交点则等于RT值。 42 43 v例： 实验室做外周血WBC的GCR多点分析，3H -Dex的SA为38.0Ci/mmol，放化纯为99%， 配成工作浓度10uCi/ml. 44 1、加样程序 WBC/GCR 3H-Dex多点RBA 编编号3H-DexDex(ul)PBS补补足体 积积ul细细胞ululnM TB1104.38 90500 NSB1104.38585500 TB2208.77 80500 NSB2 TB32510.95 75500 NSB32510.9512.562.5500 TB43013.16 70500 NSB4 TB54017.54 60500 NSB54017.541540500 TB65021.93 50500 NSB65021.932525500 45 2、测量结果 WBC/GCR 3H-Dex多点RBA测测量结结果 编编号 3H-Dex （ul) TB（ cpm）NSB（cpm）T(cpm) 1101786569144530 2202799 289060 32533221375361325 4303627 433590 54042352117578120 65047402690722650 46 3、建立NSB的回归方程 v以NSB管的cpm对3H-Dex的体积数（10、20 、25、3040、50）建立回归方程，得到： Y=52.5456X+45.7007（r=0.9997） 将未做的NSB管对应的3H-Dex体积（20、40 ）代入方程，得到NSB各管值。 （10、571）；（20、1097）；（25、1359） ；（30、1622）；（40、2148）；（50、 2673） 47 4、计算B、F和B/F 3H-Dex（ul)SB（cpm）F（cpm）B/F 1012151427440.008512 2017022862610.005946 2519633580030.005483 3020054299630.004663 4020875738850.003637 5020677179100.002879 48 5、换算B相对应的3H-Dex 物质量 比放= SA为38.0Ci/mmol，放化纯为99%， Eff=42% 1、38Ci/mmol=38uCi/nmol=1.406106Bq/nmol 2、1nmol=1.406106Bq0.99=1.4202106Bq