实验12乙型肝炎病毒标志物的检测课件

实验十二 乙型肝炎病毒标志物的检测 实验目的和要求 1、熟悉ELISA的原理及操作方法 2、掌握乙型病毒标志物的临床意义 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原 或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把 受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不 同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方 法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最 后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的 比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反 应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故 可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感 度。 （一）基本原理 （二）实验材料 n1、HBV标志物检测的试剂盒:可用于测定抗 原，也可用于测定抗体。在这种测定方法 中有3种必要的试剂： n固相的抗原或抗体， n酶标记的抗原或抗体， n酶作用的底物。 n2、待检血清 n3、微量加样枪、塑料滴头、37水浴箱 1、双抗体夹心法 n双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤 如下： n（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体 ：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 n（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时 间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形 成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （三）实验方法 n（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的 抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的 酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与 标本中受检物质的量正相关。 n（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底 物成为有色产物。根据颜色反应的程度进 行该抗原的定性或定量。 1、把抗体固定 在固相支持物 上（96孔板） ； 2、加入蛋白质 样品保温，再 洗去未结合的 杂蛋白； 3、加入第二抗 体，第二抗体 结合一个供检 测用的酶（辣 根过氧化物酶 ） 4、洗去未结合 第二抗原，酶 活测定。 双抗体夹心法测抗原 2、间接法测抗体 n间接法是检测抗体最常用的方法，其原理 为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结 合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤 如下： n（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成 固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质 。 n（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体 与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。 经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体 。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不 能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去 。 n（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体 结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤 后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的 量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶 标羊抗人IgG抗体。 n（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检 抗体的量。 n 本法只要更换不同的固相抗原，可以用 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 。 间接法测抗体 1 1、乙肝病毒的形态结构、乙肝病毒的形态结构 （四）应用 乙肝病毒标志物的检测 大球形颗粒大球形颗粒 （ DaneDane颗粒，有感染性的完整颗粒）颗粒，有感染性的完整颗粒） HBsAg （外衣壳蛋白） HBcAg （内衣壳蛋白） HBV DNA DNAP 小球形颗粒 过剩的衣壳 （ HBsAg） 管形颗粒 （1）表面抗原（HBsAg）与表面抗体（抗-HBs） n存在于三型颗粒中 n是HBV感染的主要标志，见于急性、慢性、 携带者 n抗-HBs，保护性抗体（中和抗体），标 志着机体对HBV有免疫力，见于恢复期、既 往感染者或接种疫苗后 2、HBV的抗原抗体系统 （2）核心抗原（HBcAg）与核心抗体（抗HBc ） n内衣壳，仅存在于感染的肝细胞核内，不 易在血液中检出 n抗原性强，刺激机体先产生IgM，后产生 IgG，后者可在血清中存在多年 n抗HBc无中和作用，高效价抗HBc IgM提 示病毒在体内复制增殖。 （3）e抗原（HBeAg）与e抗体（抗-HBe） n可溶性蛋白，游离存在于血液中 它的消长与DNA聚合酶及Dane颗粒出现的时间 一致，为病毒复制和血清有强传染性的标志。 n抗-HBe有一定保护作用，是传染性低、预后好 的征象。 乙肝病毒抗原抗体系统（二对半 ）检测的临床应用 乙型肝炎的诊断 判断传染性 判断预后 筛选献血员 检测疫苗接种效果 流行病学调查 乙肝病毒抗原抗体系统结果