单克隆抗体及应用ppt课件

单克隆抗体及应用 (monoclonal antibody, McAb or mAb) 一.概述 克隆：无性繁殖的细胞株 单克隆：由一个细胞无性繁殖而来 的一个细胞株（一团细胞），其中所 有细胞特性完全一样 （一）单克隆抗体： 针对Ag分子表面某一抗原决定簇（又 称表位）而产生的抗体分子，称 McAb。 单克隆抗体单克隆抗体由一个由一个B B细胞克隆产生的细胞克隆产生的 识别单一抗原表位识别单一抗原表位的同源抗体。的同源抗体。 （二）产生 1. 1975年Kohler and Milstein首 创用杂交瘤技术成功制备McAb 2.80年代初用基因工程成功制备 McAb （三）制备McAb的方法 1.杂交瘤技术 2.基因工程技术 二. 杂交瘤技术制备 单克隆抗体 1.B细胞(浆细胞）特点： 1)能产生抗体 2)但不能在体外长期培养 3)细胞内含HGPRT酶（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核 糖转化酶）和TK酶（胸腺嘧啶核苷激酶），可 通过旁路途径合成DNA 2.骨髓瘤细胞 1)能在体外长期培养 2)不含HGPRT和TK酶 3.杂交瘤细胞具有以上两种细胞的共性： 既能产生抗体、在体外能长期培养；同时含有 HGPRT和TK酶，可通过旁路途径合成DNA 4.HAT培养液筛选出杂交瘤细胞 (次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）： 氨基蝶呤是抗代谢的药物，能阻断内源性合成 DNA（合成DNA的主要途径）。 那么，HAT培养液是如何选出杂交瘤细胞 呢 氨甲蝶呤（叶酸拮抗剂） 阻止合成 DNA 杂交瘤细胞（含HGPRT、 TK) 经旁路 途径 合成 DNA 主要途径 B细胞、瘤细胞杂交后，经HAT培养液培养 数日后，五种细胞的存活情况： （1） B细胞：自然死亡（不能在体外长期培养） （2）瘤细胞：HAT培养液（氨甲蝶呤）阻止细胞 合成DNA；同时无HGPRT、TK酶，不能通过旁路 途径合成DNA，故死亡 （3）B/B杂交细胞：自然死亡同（1） （4）瘤/瘤杂交细胞：死亡同（2） （5）浆细胞/瘤细胞杂交瘤细胞：可以生长 HAT培养液中氨甲蝶呤阻止 DNA合成； 但其含有HGPRT、TK酶，可通过旁路途径 合成DNA （二）杂交瘤技术制备McAb的简要步骤 1.制备能产生单抗的杂交瘤细胞 2.克隆化杂交瘤细胞 3.筛选杂交瘤细胞 4.扩大培养单克隆杂交瘤细胞 5. 收集单抗并鉴定 6. 纯化单抗 1.制备杂交瘤细胞 （1）制备能产生McAb的小鼠脾（B）细胞: Ag免疫Balb/c小鼠 测抗体 取脾 制备脾细胞悬液 计数 （2）细胞融合：脾细胞（B)小鼠骨髓瘤 细胞杂交 脾细胞(1-5107/ml): 瘤细胞（107-8/ml) 融合剂：40%聚乙二醇（PEG) Click to edit Master title style Click to edit Master subtitle style 1616 * * (3)筛选：培养过程中加入 HAT培养液，培养14天，存 活细胞为杂交瘤细胞。 2.鉴定：将筛选出的能产生所需抗体的 杂交瘤细胞进行鉴定： 方法：检测杂交瘤细胞培养的上清液中有无 目的Ab，常用ELISA、IF间接法 包被已知Ag杂交瘤细胞培养上清（Ab？ ）洗涤，酶标羊抗鼠IgG 洗涤，底 物根据显色判断有无特异Ab 3.克隆化 （1）有限稀释法：特异性杂交瘤细胞稀释： 7-10个/ml,取0.1ml/孔，反复稀释培养、经 ELASA间接法筛选、检测特异抗体 （2）显微操作法：直接在显微镜下取单个杂 交瘤细胞培养、测特异抗体 筛选和克隆化应反复交叉进行。 4.冻存或扩大培养 （1）在液氮中冻存鉴定后的杂交瘤细胞 备用，需要时复苏 （2）扩大培养（增殖），可得到大量单 克隆抗体 体外法：将杂交瘤细胞在细胞培养瓶中进 行培养、传代 体内法：将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内， 利用它具有瘤细胞的特点能大量繁殖，产生腹 水，腹水中有大量的单抗 5.鉴定 （1） 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定单克隆抗 体的纯度； （2）用ELISA、免疫电泳法鉴定抗体特 异性 6.纯化 盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤法 、 亲和层析法 任选1-2种 Ag免疫动物 ELISA间接法测定抗血清 分离脾细胞 制备骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT 筛选杂交瘤细胞 选出产生单抗的杂交瘤细胞 反复克隆化、筛选 选出能产生单抗的单克隆杂交瘤细胞株 细胞冻存 扩大培养 单抗 分离提纯 杂交瘤技术制备单克隆抗体流程 （三）杂交瘤技术制单抗的优缺点 优点： 1.制备的单抗特异性高、效价高、产量高 缺点： 1.需特殊条件、无菌操作、难得到稳定细胞株； 2.抗体为抗鼠的IgG抗体，长期用于人体不利 三.人源单克隆抗体 （一）概念：单克隆抗体为人IgG （二）制备目的：用于人 （三）杂交瘤技术制人源单抗的方法 1.人B细胞+鼠瘤细胞 杂交后不稳定 2.人B细胞+人瘤细胞 大多人瘤细胞含有HGPRT酶 3.人B细胞+人淋巴母细胞样细胞 恶性、难以获得 4.EBV转化能产生Ab的B细胞 转化过程复杂 四.基因工程制备单克隆抗体 （一）概念：在基因水平上对编码抗体的基因进行切 割、拼接或修饰，甚至人工合成，然后导入受体细胞 内表达而产生的抗体（单克隆抗体）。 人人- -鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体(chimeric antibody)(chimeric antibody) 重构重构抗体抗体(reshaped humanized antibody)(reshaped humanized antibody) 小分子抗体小分子抗体:Fab:Fab片段片段 Fc Fc片段片段 Fv Fv片段片段 双特异性抗体双特异性抗体(bispecific antibody)(bispecific antibody) Ig-Ig-融合蛋白融合蛋白，抗体抗体导导导导向向酶酶等等 （二）基因工程抗体种类 1.嵌合抗体 （1）概念 用DNA 重组技术将鼠源单抗基因的可变区（V 区）基因与产生人Ig的恒定区（C区）基因相 连接，构成嵌合基因，导入受体细胞（骨髓瘤 细胞），表达出嵌合抗体。 嵌合基因：红色 鼠 McAb可变区基因；绿 色人Ig的恒定区基因 嵌合抗体：可变区为鼠 McAb部分，其它部分为 人Ig部分 构建成功的嵌合抗体 抗乳腺癌 1986 抗结肠癌 1987 抗肺癌 1987 抗CEA（癌胚抗原） 1989 抗HBsAg 1990（我国） 抗T表面受体 BMAO31-IgG 1991（我国） （2）嵌合抗体优点： a.免疫原性低，有利于用于人体 b.在人体内半衰期较鼠单抗长 c.在人体内生物学作用（如CDC、ADCC ）较鼠单抗强 d.与人/人杂交瘤比，体外传代更稳定 (3) 嵌合抗体制备流程：（不用记） a.提取能产生McAb杂交瘤细胞的DNA、RNA 、mRNA b.建立基因文库：分纯轻、重链V区基因 c.测轻、重链V区基因DNA序列 d.与人Ig轻、重链C区基因及表达载体连接， 构成嵌合基因 e.导入受体细胞表达，并筛选 f.产物鉴定 2.重构抗体（Reshaped Antibody) 在嵌合抗体基础上发展而来，使嵌合抗体 进一步“人化” 以人Ig基因为框架，去掉高变区部分， 用鼠单抗高变区基因连接上，构成重构基 因，导入受体细胞表达出的抗体。 研究表明，Ig的氨基酸序列在重、轻链 各有三个高变区（与抗原结合的部位）： 重链（共450 a a）；N端3137、5168、8491 轻链（共214 a a）：N端2632、4855、9095 重构基因：绿色为人Ig 基因（框架），红色 为鼠McAb基因（高变 区部位基因） 重构抗体：所有绿色部分 均为人源，红色部分为鼠 源（CDR） 红色为编码鼠 单抗高变区的 基因 绿色部分为 人Ig的基因 重构 基因 重构抗体 重构抗体在临床应用更优于嵌合抗体。 3.单链抗体（具有结合抗原活性的单链蛋白） Single-Chain Antigen-Binding Proteins 是一种新的重组多肽，由一个人工设计的 短多肽接头（基因）将编码轻链V区基因的C末 端与编码重链V区基因的N末端相连接，然后整 合到大肠杆菌基因上，表达出能特异性结合抗 原的融合蛋白 N端 C端 .1988年美国Bird首次成功构建并 表达了牛生长激素(BGH)的单链抗体 .1989年Chaudhary构建并表达成 功IL-2受体的单链抗体 单链抗体优点： 1.分子小，在血清中比McAb或Fab段清除快 2.无Fc段，免疫原性低 3.较McAb更易进入实体瘤细胞周围微循环中 4.可将多肽接头设计为具有特殊功能的位点如： 金属螯合物、毒素、药物，用于影像、治疗等。 五. 单克隆抗体的应用 （一）细菌学方面 1.用于诊断 用针对某一细菌的单抗检测细菌抗原 2.用于研究 （1）用单抗研究细菌表面抗原的成分：如用 抗淋球菌脂多糖的单抗可以与脑膜炎双球菌反 应，证明这两种菌的脂多糖有相同的成分 （2）抗结核某些菌株的单抗可作为流行病学 调查的工具 （二）病毒学方面 1.快速诊断 如肝炎、爱滋病、麻疹、流行性出血热、登革热 等多种病毒感染疾病 2.病毒学研究 （1）如流感抗原的变异（神经氨酸酶改变），单抗 更易确定抗原变异的部位，便于掌握变异规律，提前 预报 （）疱疹病毒的快速分型 3.病毒性疾病的治疗和预防 （1）治疗 单抗用于治疗，特异性高，所需量小，减少 变态反应发生。 （2）预防 用单抗选择出病原微生物有效部分，有利于 亚单位疫苗制备，提高疫苗效果，减少其副作用 （三）肿瘤方面的应用 1.诊断 （1）用荧光标记的单抗对手术及体检标本作癌 的诊断 （）用于白血病分型 2.肿瘤的治疗 （1）抗肿瘤抗原的单抗直接治疗 （2）单抗作为抗癌药物的载体，使药物准确 达到靶细胞，提高局部药物浓度，减少药物对 其它细胞的副作用 3.单抗在肿瘤应用中存在的问题 （1）一种肿瘤要制备相应的单抗 （2）同一肿瘤细胞抗原有差异，使用单抗有局 限性 （3）肿瘤细胞抗原有调变性，局限了单抗的使 用 （4）治疗有一过性 （5）鼠源单抗多次使用效果不好，并可出现超 敏反应 （四）在寄生虫学方面 1.抗血吸虫单抗可