溶血性贫血的实验室检查_2课件

单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 * * 1 1 溶血性贫血的实验室检查 l辽宁中医药大学附属医院 l高万里 l溶血性贫血的概念 l溶血性贫血的分类 l主要溶血性贫血的病因分类及常见疾病 l溶血性贫血的临床特点 l溶血的实验室检查 l溶血性贫血的常用实验室检查及意义 l血管内和血管外溶血的鉴别 溶血的概念 l溶血 ：病理状态下，红细胞的寿命缩短， 红细胞过多、过早被破坏，称之为溶血。 l代偿性溶血：在溶血情况下，骨髓代偿性 增生，生成红细胞的效率可以补偿过早、 过多消亡的红细胞，而不出现贫血，称之 为代偿性溶血。 l溶血性贫血：红细胞的破坏过速、过多， 超过代偿能力所发生的贫血，称之为溶血 性贫血。 获得性溶血性贫血 l免疫因素：（存在有破坏红细胞的抗体） 自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、阵发性冷性血 红蛋白尿、药物诱发的免疫性溶血性贫血、新生儿同种免 疫性溶血性贫血、溶血性输血反应 l膜缺陷：阵发性睡眠性血红蛋白尿 l感染因素：原虫、病毒、支原体及细菌感染等 l化学因素：某些化学药物及毒素，如苯肼、砷化氢、蛇毒 等 l物理及机械因素：大面积烧伤、心脏瓣膜异常、人工瓣膜 、血管病变、微血管溶血性贫血 l其他：脾功能亢进 溶血性贫血的临床特点 l急性溶血性贫血：1.起病急骤、2.寒战高 热、3.头痛恶心呕吐、4.面色苍白黄疸、 5.严重者可出现周围循环衰竭或急性肾功 能衰竭. l慢性溶血性贫血：1.起病缓慢病状轻微、 2.贫血黄疸肝脾肿大三联症、3.可以并发 胆石症和肝功能损害. 溶血的实验室检查 l检查内容 l反映红细胞破坏增生的检查 l反映红细胞寿命缩短、易于破坏的检 查 l有关红细胞代偿性增生的检查 检 查 目 的 l肯定溶血证据 l确定主要溶血部位 l寻找溶血原因 反映红细胞破坏增生的检查 l间接胆红素增高 l尿中尿胆原排泄增加 l粪便中粪胆原排泄增加 l血清结合珠蛋白降低 l血浆游离血红蛋白明显增加 l尿含铁血黄素阳性 l血红蛋白尿 l高铁血红蛋白血症 反映红细胞寿命缩短、易于破坏的 检查 l红细胞畸形、破坏红细胞增多 l单核-巨噬细胞吞噬红细胞现象 l红细胞寿命缩短 l红细胞脆性增加 有关红细胞代偿性增生的检查 l网织红细胞增多 l血中出现大量幼红细胞 l血中大红细胞 l骨髓中幼红细胞明显增生 溶血性贫血的常用实验室检查及意义 l红细胞渗透脆性试验增高：遗传性球形红 细胞增多症、椭圆形红细胞增多症 l抗人球蛋白试验阳性: 1.自身免疫性溶血性贫血 2.药物免疫性溶血性贫血 3. 新生儿同种免疫溶血病 4.冷凝集素综合征 l酸溶血试验阳性：PNH（作为肯定诊断） lROUS试验阳性：PNH（作为筛选检查） l蔗糖溶血试验：PNH（作为筛选检查） l热溶血试验：PNH（作为筛选检查） l高铁血红蛋白还原试验 ：还原率降低 葡萄糖-6 -磷酸脱氢酶缺陷症 l血红蛋白电泳异常：常用于检查Hbc、HbBar等 lHbA2增高：珠蛋白生成障碍性贫血 lHbF增高：珠蛋白生成障碍性贫血 lHbH包涵体检查阳性：珠蛋白生成障碍性贫血 l异丙醇沉淀试验阳性：提示有不稳定血红蛋白 存在 l热变性试验 ：沉淀率增高 存在不稳定血红蛋白 ，大于10%有诊断意义 l镰变性试验阳性：Hbs病 l冷热溶血试验阳性：PCH病 血管内和血管外溶血的鉴别 特征 血管内溶血（细细胞外溶血）血管外溶血（细细胞内溶血） 病因 红细红细 胞内缺陷，外因素获获得性 多见见 红细红细 胞内缺陷，外因素遗传遗传 性 多见见 RBC破坏 场所 血管内（在血循环环中破坏）在肝和脾的单单核-巨噬细细胞内破 坏 发病特征 一般为为急性，也可慢性一般为为慢性，可有急性溶血危象 贫血 较较重较轻较轻 ，溶血危象时时加重 黄疸 较较明显显可轻轻可重 血间接胆 红素 增高明显显增高 肝脾肿大 少见见常见见 血管内和血管外溶血的鉴别 红细胞形态异常 可见见常见见 红细胞脆性改变 变变化小多有改变变 血浆血红蛋白 增高，常大于100mg/L轻轻度增高 血红蛋白尿 常见见无 含铁血红蛋白尿 慢性常见见一般阴性 骨髓再障危象 少见见急性溶血加重时时可见见 LDH 增高轻轻度增高 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 * * 1919 溶血象检查的原理、试剂 及操作规程 （一 ）红细胞渗透脆性试验 l实验原理 渗透脆性试验是检测红细胞对不同浓度 低渗盐溶液的抵抗力。红细胞在低渗盐溶 中，当水渗透其内部达一定程度时，红细 胞发生膨胀破裂。根据不同浓度的低渗盐 溶液中红细胞溶血的情况，反映红细胞表 面积与容积的比值，反映其对低渗盐溶液 的抵抗性。比值愈小，红细胞抵抗力愈小 ，渗透脆性增加。反之抵抗力增大。 l试 剂 171mmol/LNaCl溶液（10g/L） 取经100烘干的分析纯氯化钠0.7g置 100ml容量瓶中，加少量双蒸水溶液解后， 再加双蒸水至刻度。 l样品要求 静脉血4-5ml l操作程序 1. 静脉血4-5ml放入盛有玻璃珠的三角烧瓶 内轻轻摇动（去掉纤维蛋白），直到血液 不凝为止。将此血液放入离心管内离心10 分钟左右，去掉血浆，再用0.9%的NaCl反 复洗涤三次，再配成10%RBC悬液，分别 于下列每管加一滴。表格如下： 试试管号12345678 0.7%NaCl1.251.201.151.101.051.000.950.90 蒸馏馏水00.050.100.150.200.250.300.35 NaCl 浓浓度（ %) 0.700.670.640.620.590.560.530.50 试试管号910111213141516 0.7%NaCl0.850.800.750.700.650.600.550.50 蒸馏馏水0.400.450.500.550.600.650.700.75 NaCl浓浓度（ %） 0.480.450.420.390.360.330.300.27 2. 混匀、经过两小时观察RBC始溶及全溶 NaCl浓度 l分析结果 静置室温2小时，从高浓度试管开始观察 ，上层溶液开始出现透明红色且管底有红 细胞者为开始溶血管；溶液透明红色，管 底完全无红细胞者为完全溶血。 l参考值 正常溶血：初溶0.42-0.46%；全溶0.28-0.33 注：本试验需有正常对照。 l临床意义 l 脆性增加 主要见于遗传性球形红细胞增多症，椭 圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血 性贫血。 l 脆性降低 主要见于珠蛋白生成障碍性贫血，血红 蛋白C、D、E病，低色素性贫血，肝疾病 等。 （二）抗人球蛋白试验（ Coombs试验） l实验原理 l抗人球蛋白试验（Coombs试验） 检测自身免疫性溶血性贫血的自身抗体（ IgG）。分为检测红细胞表面有无不完全抗体的 直接抗人球蛋白试验和检测血清中有无不完全抗 体的间接抗人球蛋白试验。直接抗人球蛋白试验 应用抗人球蛋白试剂（抗IgG和/或抗C3d）与红 细胞表面的IgG分子结合，如红细胞表面存在自 身抗体，出现凝集反应。间接试验应用Rh（D） 阳性O型正常人红细胞与受检血清混合孵育，如 血清中存在不完全抗体，红细胞致敏，再加入抗 人球蛋白血清，可出现凝集。 l试剂 抗人球蛋白试剂IgG l 样品要求 机械抗凝的静脉血3ml，用0.9%NaCl洗 涤数次，取RBC备用。 l 操作程序 1. 取10支小试管，每管加入0.85%生理盐水0.5ml ，取1：5抗人球蛋白血清0.5ml，加入第一，充分 混匀，再从第一管取出混合液0.5ml注入第二管混 匀，再取0.5ml注入第三管，依次下去直至第10管 ，取出0.5ml弃去，则每管的浓度为1：10，1：20 ，1：40，1：80，1：160，1：320 2. 将不同浓度的液体，分别滴一滴于玻璃板上（ 用一滴管由低浓度向高浓度加） 3. 将10%病人RBC分别滴加一滴于上述玻板液滴 内，同时充分混匀，15分钟后观察结果。 l结果分析 RBC凝集为阳性（需要正常对照） l参考值 正常人直接和间接抗人球蛋白试验均为阴性 l临床意义 自身免疫性溶血性贫血，冷凝集素综合征，新生 儿同种免疫性溶血，阵发性冷性血红蛋白尿，药 物性免疫性溶血等直接抗人球蛋白试验阳性。 （三）酸溶血（Hams）试验 l实验原理 PNH患者体内存在对补体敏感的红细胞 。Hams试验即红细胞在酸性（PH6.4-6.5） 的正常血清中孵育，补体被激活，PNH红 细胞破坏而产生溶血，而正常人RBC不被 溶解，无溶血现象。 l试剂 1. 1/6N HCL 2. 8.5g/L NaCl溶液 l样品要求 1. 机械抗凝静脉血5ml，用0.9%NaCl洗涤 数次，取RBC备用（需同时用同型或O型正 常人对照）。 2. 静脉血2ml分离出血清备用 l操作程序 1. 取两支小试管分别注入患者血清0.25ml 2. 一管加入患者50%的RBC悬液0.0125ml ，再加入1/6 N HCL0.025ml 3. 另一管加正常人同型或者O型者50%的 RBC悬液0.0125ml，加入1/6 N HCL0.025ml 4. 以上两管充分混匀，加棉塞于37温 箱中一小时观察有无溶血现象（可离心后 观察） l参考值 正常人 阴性 l临床意义 本试验阳性主要见于PNH，确诊意义大。某些 自身免疫性溶血性贫血发作严重时可呈阳性 （四） 热溶血试验 l实验原理 利用患者的红细胞在其自身的血清（含 补体）中于37孵育后，由于葡萄糖分解 产酸使血清酸化，从而导致溶血的发生。 l样品要求 静脉血3ml（分成两管） l操作程序 取静脉血3ml，注入两支小试管中（各加 入1.5ml），倾斜放置，一管置于室温，另 一管放37温箱中，4h，6h，12h，24h， 观察有无溶血现象（可离心观察）。 l参考值 阴性 l 临床意义 阳性见于PNH。遗传性球形红细胞增多 症和自身免疫性溶血性贫血亦可阳性，但 阳性率比PNH为低。本试验用于PNH筛选 试验。 （五） 蔗糖溶血试验 l实验原理 在离子状态蛋白质结构发生某些变化， RBC与血清免疫球蛋白之间发生抗原抗体 反应，被补体包围，PNH患者RBC由于膜 结构异常，在有补体情况下，容易破坏， 发生溶血。 l 试剂 1. 蔗糖 2. 3.8%枸橼酸钠溶液 l样本要求 枸橼酸钠抗凝静脉血2ml（ 3.8%枸橼酸 钠与静脉血比为1：9） l操作程序 将一份枸橼酸钠全血加入9份新鲜配制的 糖水中（即0.5g蔗糖+4.5ml蒸馏水+0.5ml抗 凝血，或10%蔗糖水5ml+0.5ml抗凝血）， 混合后，置37温箱中孵育30分钟，离心 沉淀。 l结果分析 如有溶血蔗糖液为红色，即为阳性。 l参考值 正常为阴性 l临床意义 PNH患者蔗糖溶血试验为阳性或溶血率 增加，可作为PNH的筛选试验。自身免疫 性溶血性贫血有的可为阳性，白血病、骨 髓硬化时可出现假阳性。 （六）尿含铁血黄素试验 （Rous试验） l实验原理 当血红蛋白通过肾滤过时，部分铁离子 以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并 随尿排出。尿中含铁血黄素是不稳定的铁 蛋白的聚合体，其中的高铁离子与亚铁氰 化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝色 的亚铁氰化铁沉淀。尿沉渣肾小管细胞内 外可见直径1-3m的兰色颗粒。 l试剂 1. 2% 亚铁氰化钾水溶液：用时新鲜配制 。 2. 3%盐酸 l样品要求 新鲜晨尿10ml l操作程序 1. 取新鲜尿离心沉淀，去掉上清液。 2. 取等量的2%的低铁氰化钾和1/5 N HCL 混合。 3. 将管（2）之酸性低铁氰化钾注入尿的沉 渣试管中混合，在室温中静置10-20分钟， 离心沉淀取沉渣镜检。 l 结果分析 如有兰色颗粒则为阳性。 l参考值 正常人为阴性 l临床意义 Rous试验阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁 排除出。无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血 管内溶血如PNH，本试验结果即呈阳性，并可持 续数周。但在溶血初期，虽然有血红蛋白尿，上 皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄素，此时本 试验可呈阴性反应。 （七） 红细胞形态观察（涂片、 染色、镜检） 成熟红细胞的形态观察对诊断溶血性贫血具 有重要意义，它可为本病的诊断提供重要的线索 和根据；如遗传性球形红细胞增多症时可达20- 30%以上，严重者可达100%；遗传性椭圆形红细 胞高达50-90%；靶形红细胞主要见于地中海贫血 和其他血红蛋白病。某些获得性贫血如自身免疫 、感染、理化和机械因素所致的溶血性贫血，亦 可因红细胞损害而出现红细胞形态改变，其中最 主要的为出现球形红细胞和红细胞的碎裂现象。 （八）网织红细胞检验 l概述 l 网织红细胞是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间，尚未 完全成熟的红细胞，因网织红细胞胞质内残留有多少不等 的核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质，用碱性染料（如煌焦 油蓝或新亚甲蓝）进行染色后呈绿色网状结构，故称为网 织红细胞。 l 网织红细胞较成熟红细胞体积稍大，直径为8-9.5m， 在瑞氏染色后的血涂中为嗜多色红细胞。 l 新鲜血液中的红细胞用核酸荧光染料染色后，在流式细 胞仪或某些以流式细胞术为原理的血细胞分析仪上计数网 织红细胞的百分比和每升血液中的绝对值。 l 在一些全自动血细胞分析仪上，还可直接测量网织红细 胞的体积，体积分布宽度，血红蛋白含量等参数。 l参考值 1. RC百分比：手工法 0.5-1.5% 仪量法 0.5-2.0% 2. RC绝对值：手工法 （24-84）109/L 仪量法 （29-75）109/L 3. RC成熟指数 ：10-34 4. RC血红蛋白含量 ：30.4-35.8Pg（成人） l临床意义 网织红细胞计数是反映红细胞系统造血旺盛的 可靠指标，临床常用相对百分比反映网织红细胞 的数量变化，但易受红细胞比容的影响。网织红 细胞绝对技术较相对百分比更为准确。网织红细 胞成熟指数（RMI）能反映骨髓红系细胞造血活 性，并可用于贫血的进一步分类。网织红细胞血 红蛋白含量（CHr）可以更早期、灵敏的反映红 细胞血红蛋白的合成，对缺铁性贫血的早期诊断 、疗效观察及功能性缺铁的鉴别有重要意义。 1. 网织红细胞计数 l（1）溶血性贫血时，骨髓红系因受到缺氧及大量 红细胞破坏产物的刺激而增生，未完全成熟的红 细胞提前释放到外周血，使网织红细胞增多，常 在5%以上。急性溶血性贫血时，网织红细胞可高 达50%以上。 l（2）急性失血时，网织红细胞可明显增多，其增 高的幅度依赖于出血量的多少，一般在出血后的 第2-3天达峰值，可达5-15%，出血停止后网织红 细胞逐渐恢复正常，临床上可据此判断出血是否 停止。 l（3）缺铁性贫血及巨幼细胞贫血时，网织 红细胞可正常、轻度升高或减低，当给予 足够的铁剂或VB12及叶酸治疗，用药一周 内网织红细胞开始上升，在24周后达高峰 ，一般增至5%以上，可达10-20%。随后网 织红细胞数量逐渐下降，红细胞及血红蛋 白则逐渐增高，这一现象称为网织红细胞 反应，可以作为贫血治疗有效的判断指标 。 l（4）再生障碍性贫血时，网织红细胞减少 ，一般网织红细胞常低于0.5%，部分慢性 再障患者网织红细胞百分比可为1%左右， 但其绝对值计数明显减低。临床将网织红 细胞绝对值低于15109/L，作为急性再障 的诊断指标。 l（5）骨髓病性贫血如急性白血病、淋巴瘤 、骨髓瘤患者，骨髓中肿瘤细胞大量浸润 ，使红系细胞增生受到抑制，网织红细胞 数量明显减少。 2. 网织红细胞成熟指数（RMI） l RMI增高时红系细胞造血应激反应的早期信号 ，此时网织红细胞数量可能仍处于参考范围内。 l 急性大出血后，58h即可见成熟网织红细胞增多 ，RMI增大，而网织红细胞数量常在2天后才会出 现有意义的增高。 l 红细胞生成素（EPO）治疗后，红系造血应激 反应随之而出现，RMI升高可作为骨髓移植后造 血功能重建的一项早期观察指标。 3.网织红细胞血红蛋白含量（ CHr） l 缺铁性贫血的早期诊断：缺铁性贫血时，CHr 明显减低 。当体内贮存铁减低但尚未出现贫血， 即处于潜在性缺铁期时，CHr先于血红蛋白和血 清铁等减低。当CHr的临界值（cut-off)75% l临床意义 G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白的还原率下 降。中间缺乏（杂合子）为31-74%，严重 缺乏（半合子或纯合子）95%,HbF2%,HbA2 为1.0-3.1%。PH 8.6TEB缓冲液适合于检出HbA 、HbA2、HbS、HbC、但HbF不易与HbA分开， HbH与Hb Barts不能分开和显示，应再选择其他 缓冲液进行电泳分离。 2. PH6.5 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳 主要用于HbH和Hb Barts的检出。HbH等电点为 5.6，在PH6.5TEB缓冲液中电泳时泳向阳极，Hb Barts则在点样点不动，而其余的血红蛋白都向阴 极移动。 l临床意义 1. 通过与正常人血红蛋白电泳图谱进行比 较，可发现异常血红蛋白的区带。如HbH 、 HbE、Hb Barts、 HbS、HbD、 HbC等 异常血红蛋白的异常。 2. HbA2增多，见于珠蛋白生成障碍性贫 血，为杂合子的重要实验室诊断指标。 HbE病时也在HbA2区带位置出增加，但含 量很大（在10%以上）HbA2轻度增加亦可 见于肝病，肿瘤和某些血液病。 溶血性贫血实验室检查筛选试验 主要临床表现： 黄疸、贫血、肝脾肿大等。 血象检查：红细胞计数 红细胞形态 网织红细胞计数 尿液检查：尿胆原 血红蛋白尿 含铁血黄素尿 生化检