基础生物化学实验课件ppt酶联免疫吸附测定bsa抗体效价

酶联免疫吸附测定BSA抗体效价 1.目的要求 (1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。 (2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及 酶联免疫测定仪的使用。 2.基本原理 免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后， 作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定 Ab/Ag。 免疫反应：一次或数次 具Ag,Ab特异的免疫学反应 酶促反应：只进行一次 显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg 60年代初期，Averameas & Ram等 建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶-人血清白 蛋白及酸性磷酸酯酶-抗体，统称为酶标记物或酶结 合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称为Elisa)-是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技 术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。 1974年 Voller等 用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗 原)，再与相应的酶标记物结合 操作更方便，易重复 灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)， (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 免疫标记技术 应用各种液相和固相免疫 分析方法，对体液中的半 抗原、抗原或抗体进行定 性和定量测定 标记抗体或抗原 荧光素、放射性同位素、酶、 铁蛋白、胶体金及化学(或生物 )发光剂 镜检观察或进行自 动化测定 荧光显微镜，射线测量仪，酶标 检测仪，电子显微镜和发光免疫 测定仪等 直接在细胞、亚细胞、 超微结构及分子水平上 ,对抗原抗体反应进行 定性和定位研究 酶-性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色 ，便于检测 常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等 。 酶标技术 戊二醛法， 过碘酸氧化法 将酶与Ab交联在一起 Ag-Ab-抗Ab-HRP TMB+H2O2 产物（黄色，OD450)+H2O 图一 直接型Elisa 图二 间接型Elisa 图三 双抗体夹心型ELISA 图四 固相抗体竞争型ELISA 未知抗原量=A（1）-A（2） 每次反应后都要反复洗涤？ 1. 保证反应的定量反应 2. 防止重叠反应，引起非特异现象。 Partially purified, inactivated HIV antigens antigens pre-coated onto an ELISA plate Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate. Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies. substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody. HIV (human immunodeficiency virus) detection positive negative Protein protein interaction-ELISA 1. Direct elisa different epitope Coat with prey protein Incubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein - 2.Competitive elisa same epitope Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein 4. 操作方法 4.1 包被特异性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Og/ml ，每凹孔加100L，加盖置4过夜(37 2h)，次日倾去凹孔内液体 ，用滴管取洗涤液在每孔中加34滴，静置3min后倾去，重复3次，将 反应板扣放在滤纸 上，以除净液体。 4.2 封闭闭: 每孔中加入200400L封闭液，加盖或用封口膜封板，置 37恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。 4.3 加待测测血清(内含抗体)、阴性血清(无抗体)及稀释释液 (PBS/Tween): 待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等)，阴性血清也稀 释成1:100，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液 (PBS/Tween)各1OOL加至相应的凹孔中，加盖或封板，置37恒温 箱1h，使抗体与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。 1 2 3 4 5 6 7 8 PBS/Tween 1:100阴性血清 1:1,000 1:5,000 1:10,000 1:20,000 1:50,000 1:100,000 阳性血清 4.4 加酶标标抗体:按说明书要求用稀释液稀释HRP-抗体(抗抗体)， 每孔加l00L，封板后置37温育lh，按上法至少洗涤5次，最 后用蒸馏水洗涤2次，扣在滤纸 上吸干水分。 4.5 显显色: 每孔加入OPD应用液1OOuL、反应板置室温暗处530min 。当显示橙色时应 及时终 止反应。 4.6 终终止反应应:每孔加入5OL 2mol/L H2SO4。稳定35min即可比 色测定。 4.7 检测检测 : 用酶联免疫测定仪，以PBS/Tween孔为对 照、测波长 为49Onm时各孔光吸收（A）。 1.计算阳性血清与阴性血清A值之比(Positive/negative，P/N) ，当P/N2.1时为 阳性，P/N80,00045 minutes Problem： 蛋白质转移效率低？（转移后对凝胶或膜染色进行观察 ） 1. transfer buffer中加入20甲醇或加入终浓度为 0.1%SDS, 可增加膜结合蛋白质的能力； 2. 使用小孔径的硝酸纤维素膜 3. 转移后的膜在含0.2%戊二醛的TBS中浸泡45min 。 丽春红S， 染色后可继续进行免疫检测 灵敏度低 氨基黑 印