肿瘤血管生成及检测课件

肿瘤血管生成 及检测 重庆医科大学 病理教研室 院长 人体肿瘤大部分为实体瘤(solid tumors)。实体瘤瘤组织由瘤细胞和间质构 成，后者主要包括血管、淋巴管、结缔组织 、炎细胞及细胞外基质等成分。其中，血管 和结缔组织起营养、支持瘤细胞的作用。 肿瘤内的新生血管和淋巴管分别通过 血管生成(angiogenesis)和淋巴管生 成(1ymphangiogenesis)实现的， 并在肿瘤的生长和扩散(侵袭和转移) 中起重要作用。已有研究证明，肿瘤 血管生成活跃程度对组织病理分级、 放射治疗以及在预后判断上都有重要 的评估价值。 第一节 肿瘤血管生成的基本过程 一、血管生成现象 (一)血管生成的概念 1945年Algire提出了“肿瘤血管生成 (tumor angiogenesis)”或“血管新生化 (neovasclarzation)”概念。对血管生成重 要性的认识，特别是提出“肿瘤生长依赖 于血管生成”观点，始于1 971年Folkman 对肿瘤血管生成的研究报道。 血管生成是指活体组织在已存在的微血管 床上芽生(sprouting)出新的以毛细血管为 主的血管系统的过程。 有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成 新血管的过程即血管形成 (vasculogenesis) (二)血管生成的研究方法 鸡胚绒毛尿囊膜试验 角膜移植实验 开窗实验 动物移植瘤等在体模型 三维胶分析法 细胞联合培养等离体模型 识别内皮细胞的免疫学标记物 :第8因子相关抗 原(factorrelated antigenFAg)、CD3l、 CD34、CDl05 血管生成因子:VEGF及其受体家族 FGF家族及 其受体 Ang和Tie受体家族 Angiotropin 血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF) 二肿瘤血管生成的基本过程 (一)血管生成的基本过程 血管生成的基本步骤是 血管生成因子的产生过多使之与抑制因子 失衡，导致内皮细胞激活，产生血管生成表 型； 血管部位细胞外基质改变、基底膜降解， 内皮细胞芽生、增殖和迁移； 新生内皮细胞索形成管状毛细血管襻 及管腔； 新生血管管腔的贯通。内皮细胞凋亡 、脱离基底膜和血管壁细胞改变可能是 血管消退的主要病理学事件。 (二)肿瘤血管生成的过程 1肿瘤生长的阶段性 无血管期(avascular phase)或称血 管前期(prevascular phase) 肿瘤直径不超过12mm 血管期(vascular phase) 肿瘤迅速生长并发生转移 2.肿瘤血管的起源 肿瘤中的血管可能有3种来源： 血管生成:以两种方式发生,一是肿瘤细胞团先处 于无血管期生长，后因缺氧而产生大量血管生成因 子，从而诱导血管生成；另一种是瘤细胞先依赖宿 主组织已存在的血管生长，继而出现瘤内血管消退 ，然后再因缺氧诱导血管生成因子作用而发生血管 生成 血管套叠性生长 内皮祖细胞 3肿瘤血管生成的过程 瘤细胞和巨噬细胞 血管生成因子 (VEGF等) 小血管毛细血管伸展 内皮细胞迁移形成毛细血管芽 新生毛细血管形成并连通 第二节 肿瘤微血管形态和生物学特性 肿瘤微血管不仅在形态上不同于正常血管，而 且在生物学功能上也有其特殊性。 一肿瘤微血管形态表现 肿瘤组织内新生的微血管一般遍布整个肿瘤组 织，但分布上并不均一。血管生成最活跃、微 血管密度最高的区域被称为所谓“血管热点区 ”(hot spots)，这也是进行肿瘤微血管密度测定 的选择区域。很多肿瘤的微血管新生主要分布 在肿瘤生长活跃的边缘。 肿瘤的新生血管分布上常常无规律，分支紊 乱，管腔不规则，可表现为狭窄、扩张或扭 曲。新生血管呈血窦状、条索状，管壁薄， 甚至仅有一层内皮细胞；或管壁很厚，但结 构上仍然不完善。内皮细胞般比较幼稚， 细胞间常有裂隙，且缺乏基底膜，有时血管 外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。 肿瘤血管的结构缺陷是这些血管具有高通透 性的结构基础，也是肿瘤转移途径之一。 不同类型肿瘤间质的血管没有本质区别，但 在形态和数量上却有不同。 生长活跃的恶性肿瘤常富于血管如内分泌 肿瘤肾癌、骨肉瘤、绒毛膜癌、破骨细胞 瘤、胶质母细胞瘤和肝细胞癌等，而硬癌、 软骨瘤和软骨肉瘤中血管甚少。 不同肿瘤血管的形态又有一定的差异，如胶 质母细胞瘤中新生血管不仅丰富，而且内皮 细胞呈不同程度的增生、肥大；绒毛膜癌、 肝细胞癌等血管呈壁薄、明显扩张的血窦。 以恶性胶质瘤为例，肿瘤组织内新生 血管的主要表现形式有: 梭形内皮细胞呈索状排列，枝状分布，有 或无明显的血管腔，呈原始、幼稚的微血管 内皮细胞增生、肥大，管腔狭小，呈现厚 壁血管 内皮细胞增生，形成球形血管壁内血管 呈现“肾小球样结构”； 管腔大、管壁较薄的相对较大的微血管， 并形成血管心假菊形团结构； 大量管壁退变和钙化的新生血管； 增生血管丛呈蛇形密集排列，形成肿瘤与 瘤周组织间的血管屏障； 血管内皮区域性极度增生，呈片状的梭形 细胞，构成“假肉瘤化”。 二、肿瘤微血管的生物学特性 低反应性 高通透性 低供氧能力 最近，Vogelstein B和Kinzler KW采用基因 表达的系列分析(serial analysis of gene expression SAGE)方法，比较研究了结直 肠癌和正常肠黏膜血管内皮细胞的基因表达 差异。结果发现二者基因表达存在差异。 他们得到了79种差异表达的转录子，其中 TEM8仅表达于肿瘤内皮而不表达于黄体形成 中的内皮细胞，提示肿瘤血管生成和生理状 态下的血管生成有明显不同。这一发现为血 管生成的基础和临床研究提供了重要资料， 也引起了血管生成和肿瘤治疗研究者的重视 。 第三节 肿瘤血管生成的调控机制 肿瘤血管生成受多种血管生成因子 (angiogenic factors)和血管生成抑制物 (angiogenesis inhibitors)的调控。肿瘤细 胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧刺激等使局 部微环境发生变化的因素作用而合成和释放 大量血管生成因子从不同环节促进血管生成 。组织中同时也存在内源性血管生成抑制因 子，对血管生成起抑制作用。 一、血管生成因子 血管生成的始动需要血管生成因子。一系列 血管生成因子、细胞因子、细胞外基质和黏 附分子及其抑制物，以及代谢性和机械性因 子均参与了血管生成过程。 已知的血管生成因子有数十种，其中 VEGF和Ang家族是已知的、特异性作用于 内皮细胞的生长因子，在血管生成中作用可 能也是最为重要的。 (一)VEGF及其受体家族 1VEGF家族及其爱体 VEGF又称血管通透性 因子(vascular permeability factor,VPF)，为分 子量3445kD的同源二聚体糖蛋白，属于碱性蛋 白。VEGF基因通过转录水平的剪切，可产生5种 变异体，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、 VEGFl45和VEGFl21，分别由206、189、165、 145和121个氨基酸组成。 其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121 二者均为可溶性分泌蛋白，扩散力强，易于到 达靶细胞。 近年又发现其他一些与VEGF功能相似、结 构上有一定同源性的多肽因子，包括胎盘生长 因子(placentor growth factor，PIGF)，VEGF -B(VEGF相关因子，VEGF-related factor， VRF)，VEGF-C(VEGF相关蛋白，VEGF- related protein，VRP)，以及VEGF-DFIGF 和VEGF-E等成员，它们共同构成VEGF家族 VEGF受体包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR- 2(Flk-1KDR)和 VEGFR-3(Flt-4) 2VEGF及其受体的作用 : 早期血管的形成需要VEGF的调节，它们与内皮 细胞上相应的酪氨酸激酶受体结合，引起内皮 细胞分裂和分化，并形成管腔样结构。 在胚胎发育过程中，VEGF(主要是VEGF-A)通 过其受体VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1 KDR)促进内皮分化、增殖、迁移和原始血管形 成. 由新形成的内皮组装成管腔样结构需要VEGFR- 1的表达和激活，而VEGFR-3的表达与内皮细胞 形成静脉或淋巴管有关。 VEGF不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原， 而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活 物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在 血管生成中发挥重要作用。 VEGF在几乎所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆 有过表达。VEGF及其受体在肿瘤中的表达常与 肿瘤分化程度密切相关。 大多数实体瘤VEGF基因均有过表达， VEGF165 VEGF121两种VEGF最常见。 在VEGF家族中，VEGF-C和VEG-D既可诱导血 管生成，又可诱导淋巴管生成。已有研究报道 ，人体多种肿瘤细胞高表达VEGF-C。 体内转基因实验也证实，肿瘤细胞VEGF-C的高 表达能选择性地诱导肿瘤组织淋巴管生成。 肿瘤组织中的VEGF-C和VEGF-D还来源于浸润 的巨噬细胞。 缺氧是包括胶质瘤细胞在内的许多细胞系产生 VEGF的一个强烈的诱导因子 离体条件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表达的诱因 。 VEGF在肿瘤坏死灶周边常呈强表达。 肿瘤中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平常 与VEGF呈正相关，NO与VEGF之间具有相互 调节作用。 多种癌基因的激活通过上调VEGF表达而诱导血 管生成，失活的抑癌基因(如突变型p53基因)也 参与了VEGF介导的血管生成过程。 (二)FGF家族及其受体 1FGF家族 目前研究最为深入的是碱性戒纤 维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长 因子(aFGF)。bFGF和aFGF在结构上是相关的 ，二者之间有53的序列同源。 2FGF的分布和生物学作用 bFGF是体内分 布广泛的生长因子之一，可在不同肿瘤中表达 ，包括膀胱癌、神经胶质瘤、肝癌、胃肠癌、 乳腺癌、肾细胞癌和甲状腺癌等许多培养的细 胞系都可以合成它。 其功能具有多样性，可促进内皮细胞的有丝分 裂、趋化性和迁移，刺激内皮细胞产生胶原酶 降解基底膜，诱导来源于中胚层和神经外胚层 细胞的增殖和分化。bFGF也表现出亲神经性行 为，促进神经元的存活和分化。 bFGF和aFGF均与肝素有很强的亲和力，研究 表明这种高亲和力对于FGF与细胞表达的受体 结合是非常重要的。 3FGF受体 bFGF的生物学作用是通过与其 特异性的细胞表面受体FGF受体(FGFreceptors ，FGFR)结合而介导实现的。已经识别4种 FGFR，包括FGFR-1(flg)、FGFR-2(bek)、 FGFR-3和FGFR-4。 FGFR-1在bFGFFGFR系统中的作用最大。 正常脑神经元和胶质细胞中FGFR-1的表达呈现 明显的异质性，即组织中有些细胞呈现FGFR-1 阳性，有些则显示阴性；血管内皮细胞亦是如 此。 (三) Angiotropin AngiOtropin是一个含铜离子的45kD核酸 与多肽的聚合物。将angiotropin加入到已汇合 的毛细血管内皮细胞培养基中，它以剂量依赖 方式刺激内皮迁移并快速排列成管样结构，这 种效应对内皮细胞是特异的。由于它是巨噬细 胞产生的化学调节剂，所以它可能启动炎症和 伤口愈合中的血管生成过程。 （四）血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF) PD-ECGF是一个酸性45kD单链多肽。 它是内皮细胞特异的有丝分裂素，能刺激人 和猪的内皮细胞增生。用PD-ECGF转染肿瘤细 胞，其裸鼠移植瘤血管密度明显增加。 (五) 其他血管生成因子 Ang和Tie受体家族 EGF TGF 粒细胞集落刺 激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-CSF GMCSF) (七)降解基底膜的相关物质 血管基底膜的降解是血管生成过程中的重要 事件，只有基底膜降解之后，内皮细胞才能迁 移入周围组织并形成血管芽。 基底膜的降解是一复杂过程，涉及一系列酶的 作用，这些酶包括基质金属蛋白溶酶、尿激酶 型纤维蛋白溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen,u-PA)；丝氨酸蛋白酶(serine proteases)、细胞外蛋白体(proteasome)、糖 苷酶(endoglycosidases)、组织蛋白酶 (cathepsins)和多形核白细胞丝氨酸蛋白酶 (serine proteinase)。 u-PA的作用涉及肿瘤的血管生成与侵袭过程。 U-PA使纤维蛋白溶酶原转为纤维蛋白溶酶,后者 能降解基质蛋白并激和几种基质金属蛋白酶。 (八)细胞外基质和基质黏附受体 在血管生成型中不但需要细胞因子与相应受 体的结合，细胞外基质(extraceIlular matrix, ECM)也起着重要作用。 内皮细胞独自在接受生长因子的刺激时只表现 增生，而在有细胞外基质的条件下，内皮细胞 才能形成管腔样结构。 二、缺氧对血管生成的诱导作用 缺氧是肿瘤和非肿瘤性疾病血管生成的重要 刺激因素。缺氧诱导的相关转录因子包括缺氧 诱导因子-1、-2(hypoxia inducing factor-l，- 2，HIF-1HIF-2)和NF-B,其中以HIF-l在血管 生成中的作用最为重要。 在肿瘤组织中，缺氧一方面可导致瘤细胞死亡 ，另一方面也刺激残留瘤细胞上调血管生成因 子的表达。 第四节 血管生成的有关检测方法 一.肿瘤血管生成的体内研究动物模型 肿瘤血管生成体内研究的生物试验模型主要有动物( 大鼠，兔等)眼角膜囊(眼前房)、地鼠颊囊、裸鼠外耳皮 下和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)等四种动物模型。国内学者 对这四种模型均有研究。有研究认为CAM是研究血管生 成较好的实验模型，其方法简便二成本低，仪器设备条 件要求不高，易于操作，便于推广；并可用于进行大样 本研究，或用于影响血管生成的因素或药物的筛选和评 价。因此，特将CAM试验方法作简单介绍： 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验: (1)鸡胚准备和接种组织：选择北京白鸡种蛋，洗净，用l ：1000苯扎溴铵(新洁尔灭)液浸泡3分钟，置378土0 5培养箱中孵育。鸡胚发育第7天，蛋壳消毒后，标 记制作2cmX3cm左右观察窗。接种组织视研究目的而 定，一定要在接种当日取材，充分清洗除去血污和粘液 ，再剪成12mm组织小块。 (2)组织接种：在制备鸡胚观察窗的次日，即鸡胚发育第 8 天进行组织接种。每个鸡胚可接种57个组织小块于接 种部位CAM表面，再用透明胶纸封好，继续孵育。 (3)接种组织的收获与观察： 组织接种后每12小时观察一 次，到组织接种第11天(鸡胚发育第18天)收获接种组织 ，取出鸡胚，置接种组织连同周围的CAM于解剖显微镜 下观察，并用10甲醛固定保存，部分组织可作石蜡切 片，用作血管生成研究的免疫组化染色等。 (4)CAM的血管生成表现：组织接种24小时后，CAM血管 开始向接种组织生长，随培养时间的延长，血管数目及 直径均明显增加；第2天，新细小血管直接趋向组织； 第3天，新生血管形成以接种组织为中心，1020条放 射状血管网；尔后，CAM血管继续明显增加。非接种部 位与接种部位比较，CAM血管数目少，大血管与小血管 呈脉样均匀分布；而接种部位的CAM血管在接种组织周 围弥散样增加，以组织为中心向周围呈放射状分布，在 首 先与组织发生联系的区域CAM血管更多。第4天，可 见 新生细小CAM血管生长形成中、粗血管，并在中、 粗血管继续分支出细小血管，形成新的血管网。CAM血 管管腔结构清晰，可区别动、静脉。 (5)CAM血管生成实验模型的用途：CAM血管生成模型 用于血管生成的研究，可取得两方面结果：检测评 价接种物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分 析研究血管生成促进因子、抑制因子的活性和作用的 检测，如肿瘤血管生成的研究等；对接种物，如肿 瘤组织、自身的血管生成进行研究，用于分析不同组 织的血管生成活性和作用，如肿瘤组织有引发新生血 管生成的作用. 对照抗血管生成药物作用以后 尽管血管生成的体内动物模型研究更为接近人体的生理 状态，使研究结果更为可靠，但Kathryn等认为仍有一 些不足之处，如操作繁琐，耗时过长；另外，在该类模 型中，血管生成物必须植入眼角膜囊、颊囊、或绒毛尿 膜囊使之诱导血管生成，难免产生人为因素诱导的血管 生成；血管生成促进因子、抑制因子等需要从多聚载体 中释放出来；操作方法和测定其结果的技术较为复杂。 由于这些不利之处，最近，Kathryn等又建立了一种新 的血管生成模型: 二.人胎盘血管培养实验(体外) Kathryn等认为不但既往的体内血管生成实验研究模型 有上述不足之处，而体外的血管生成实验研究也主要是 内皮细胞的长期培养，将内皮细胞置于细胞外基质环境 ，或者暴露于各种血管生成刺激因子，使之诱导其血管 形成。 该类体外实验研究，有很多人为因素影响，不能代表体 内生理反应，因为内皮细胞在生长因子存在的条件下培 养了很长一段时间，已被激活。因此，有必要建立一类 与体内生理反应有关的血管生成实验方法，尤其是与人 类血管生成有关的血管生成实验。 于是，Kathryn等建立了一种新的人血管生成模型。从 自愿选择剖腹产手术24小时之内的人胎盘顶端表面截取 约长25cm，直径为l2mm的表浅血管，洗去血污， 浸入Hank平衡盐溶液中。 培养在48孔培养板中进行，可在孔中分别加入 各种血管生成因子，再加l99培养基，将血管片 段在凝固前迅速加入培养孔中央，理想的是使 血管片段悬浮于培养胶中。然后将培养板置 37保湿孵育培养1421天，每周换培养基2次 。用减数成相系统计；算原来血管条生成的血 管索数量，每隔一天计数新生长形成的微血管 条数，由此描绘微血管生长曲线。 用免疫组化、流式细胞仪、电镜等分别检测了 CD34，Weibel-Palade小体标志物等， 证实 新生血管中含有内皮细胞。该实验模型不 需 要加外源性生长因子，并用该模型检测研 究 了aFGF、bFGF，三种VEGF异构体及其受 体在原代血管生长及子代新生血管形成中的 作用。结果表明该模型是筛选人类血管生成 潜在 激活增强因子和抑制因子行之有效的体 外实验 模型。 三.肿瘤微血管密度计数(MVD) 用F因子单克隆抗体在组织切片上进行免疫组织化学 染色 ,血管内皮细胞呈棕黄色 。 MVD计数按Weidner等的方法并加以改动，先在低倍 视野内找到MVD最高的区域，然后在高倍视野内计数微 血管的数目。分辨不清或染色模糊的细胞不计入结果， 单个的棕黄色内皮细胞或细胞簇作一个血管计数，但肌 层较厚及血管腔面积8个红细胞直径的血管不计数。计 5个视野的IMVD，取其平均值作为IMVD。 四.肿瘤血管生成调控因子的检测 以VEGF为例,根据实验条件和需要可以从蛋 白质水平或核酸水平进行检测: (一)免疫组织化学检测 用VEGF单克隆抗体在组织切片或细胞爬片 上进行免疫组织化学染色 , 肿瘤细胞胞浆呈棕黄 色 。 培养的子宫内膜癌细胞 VEGF阳性表达 培养的脑星形细胞瘤细胞VEGF阳性表达 培养的脑星形细胞瘤细胞VEGF阳性表 达 (二)Western blot 基本原理: 免疫印迹又称Western印迹(Western blot)，与DNA的 Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组 分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探 针检测特异性组分。不同的是，Western blot所检测的 是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于 固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。 该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏 感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴 别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体 的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫 分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。 Western blot的过程分四阶段 a.蛋白样品的制备及蛋白样品浓度测定 b. SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDSPAGE） c.蛋白质的电转移(转膜) d.靶蛋白的免疫学检测(杂交) 1.蛋白样品的制备及蛋白样品浓度测定 A.样品的制备 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0 研磨，加入5STOP buffer，180W，6mins，0超声波 破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入- ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸 10min，分装后于-20保存，用时取出，直接溶解上样 。 细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内 加入5STOP buffer，收集，180W，6mins，0超声 波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入- ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸 10min，分装后于-20保存，用时取出，直接溶解上样 。 分泌蛋白的提取： 直接收集分泌液，加入-ME、溴酚蓝制样。 B.蛋白的定量方法: a.双缩脲法： b. Lowry法： c.紫外吸收法 : e. Bradford比色法： 2.SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDSPAGE） A：实际操作 做胶前的准备 1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。 2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。 3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算 出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。 制胶，电泳 1）装好架子。 2)按照配方配制分离胶。 在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。 3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。 倒好浓缩胶后插入预先准备好的梳子。 4)待胶凝集好后，上样，电泳。上层胶用60-80V 电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。 一般电泳时间在1.5小时左右。 注意事项及常遇到的问题 1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空 间，否则起不到浓缩效果。 2）上样蛋白量不应超过样品槽。 3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表TEMED 、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电 泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够 或者系统实际不纯或失效。 4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳 带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。 5）电泳中常出现的一些现象： 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中 间冷却不好。 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别 可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚 合不完全。 拖尾：样品溶解不好。 纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。 条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。 条带两边扩散：加样量过多。 3.蛋白质的电转移(转膜): 在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至 固相载体（膜）上。 膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜 、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们 选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更 好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好 的化学兼容性。 转膜有2种方法: A .半干法 即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间， 通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。 因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷 ，但是其转移时间短，效率高。 1) 实验条件的选择 电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的 蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实 际适当调整。 目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度 转移时间(h) 80-140 8% 1.5-2.0 25-80 10 1.5 1540 12 0.75 =膜=胶