（ppt）益气活血药干预血管老化的研究及思考课件

益气活血药干预血管老化 的研究及思考 中国中医科学院 雷燕 杨静 陶丽丽 王国利 王铭 王洋 研究背景 400年前，近代临床医学之父、英国著名内 科医师奚丁汉说过一句话：“一个人的动脉有多 老，他就有多老。” 研究背景 21世纪，人类已步入了老龄化社会。随年龄增长 与衰老相关的各种血管性疾病的发生率也随之上升， 血管老化是老龄人群心血管疾病风险增加的主要原因 随着对血管病变认识的深入，已知血管壁病变的发 生发展才是各种心血管事件发生的基础，血管壁结构 和功能的异常是心脑血管疾病及急性心脑血管事件发 病的根本原因 血管衰老的表现及病理变化 血管老化（vascular aging）表现为血管僵硬度 增加、顺应性降低和动脉管壁增厚 血管衰老是人体衰老的关键始发因素,主要体现在 血管壁结构和功能的异常 动脉年龄对于维系心脏健康至关重要，而动脉年 龄又取决于血管内膜，美国匹兹堡大学谢迪赛德 医学中心的首席心脏病专家布莱恩多诺霍博士说 ，血管内膜是血管的健康卫士 血管壁结构 内膜主要由血管内皮细胞组成，其作为 血管的内衬，除具有屏障的作用外，还 有具有复杂的酶系统，能合成与分泌多 种生物活性物质，有重要的生理功能 中膜成分因血管种类而异，大动脉以弹性 膜为主，间有少许平滑肌；中动脉主要由 平滑肌组成。在病理状况下，动脉中膜的 平滑肌可移入内膜增生并产生结缔组织， 使内膜增厚 外膜由疏松结缔组织组成，含螺旋状或纵向分布的 弹性纤维和胶原纤维。血管壁的结缔组织细胞以成 纤维细胞为主，当血管受损伤时，成纤维细胞具有 修复外膜的能力 内膜中膜外膜 血管老化的分子生物学基础 血管的老化 血管内皮细胞 血管内皮细胞 血管内皮细胞 内皮细胞功能紊乱、内皮细胞凋亡、内皮 细胞通透性改变和细胞内氧化产物的聚积 平滑肌细胞从中膜迁移至内膜，并在内膜下大 量增殖，分泌活性物质,诱导并促进内皮细胞 功能失调、血管的炎性改变及重塑 外膜细胞外基质胶原增加、弹性纤维减 少和断裂、 钙沉积和非酶促糖基化增加 l增龄 l活性氧学说 lRAS( Ang及受体) l端粒酶及其活性 机制 血管衰老的机制 因素 l高血压、高血脂 、 高血糖 l吸烟 l久坐 l长期精神压力大 检测血管结构和功能的指标 抗氧化 临床 转化生长因子(TGF1） 同型半胱氨酸（Hcy） MMP-9 / TIMP-2 Ang 及其AT1R 活性氧 NO NADPH 氧化酶 p47phox 细胞外 基质 其他 脉压差 脉搏波速率（ PWV ） 踝臂指数（ABI） 动脉僵硬化指数（AASI ） 搏动指数（PI） 阻力指数（RI） 糖基化终末产物（AGEs） 细胞周期 衰 老 中医药延缓衰老研究 中医药延缓衰老 补肾健脾 益气养血 活血化瘀 调节免疫 清除自由基 抗氧化 影响端粒酶活性 研究目的和意义 构建血管老化的动物和细胞模型 探索血管老化的临床特征和分子生物学标 志 揭示血管衰老的细胞和分子机制 探讨益气活血中药延缓血管老化的效应和 机制 课题组前期工作 构建血管细胞衰老模型：血管内皮细胞(VEC) 血管平滑肌细胞(SMC) 血管外膜成纤维细胞 (VAF) 复制自然衰老大鼠/小鼠模型:心脏及血管 临床研究：衰老的高血压病患者 l以血管老化为研究对象，以Ang-NADPH氧化酶 p47phox-ROS通路为主线 l建立自然衰老小鼠、自然衰老大鼠、高血压大鼠动物 模型 l构建Ang诱衰和复制性衰老VEC模型、SMC、血管外膜 成纤维细胞 l从整体、细胞和分子水平探讨血管老化所导致的血管 壁结构和功能的改变 l采用人参三七川芎提取物进行干预 前期工作 研究结果(一) 人参三七川芎提取物可延缓Ang诱导和复制性内皮细胞 衰老,可由AT1R蛋白水平下调NADPH氧化酶p47phox的表达 ，使VEC产生活性氧减少，进而延缓细胞的衰老 中药提取物可延缓衰老小鼠血管老化的进程，改善小鼠主 动脉形态学衰老变化，通过降低血管组织中活性氧的生成 ，减少AGEs的产生，抑制MMP-2的活性，调节MMP-2/TIMP- 2的平衡，达到降低衰老小鼠血管僵硬度、减少血管重构 、延缓小鼠血管老化的发生 SA-gal染色细胞衰老测定 中药高剂量组 中药低剂量组 8代衰老组 VitE组 血管内皮细胞，光镜x400 -gal染色显示，8代衰老组表达-gal蓝染细胞较多，大约78.33% ； VitE组蓝染阳性细胞数约39.00% ；中药高剂量组阳性细胞约 49.33% ，低剂量组阳性细胞约44.67% 内皮细胞周期 Ang衰老模型组 年轻对照组 中药高剂量组 中药低剂量组 valsartan组 内皮细胞内ROS含量 8代衰老组 VitE组 中药高剂量组 中药低剂量组 激光共聚焦显微镜x100 细胞p47phox、AT1R、AT2R蛋白表达 与VitE组比较，8代衰老组p47phox，AT1R，AT2R表达明显上调； 与8代衰老组比较，中药高、低剂量组与Vit E组p47phox表达明显下 调，AT1R，AT2R表达明显下调；与Vit E组比较，中药高、低剂量组 p47phox，AT2R表达上调，AT1R表达仅有上调趋势，无明显差异 研究结果(二) 增龄与高血压对大鼠主动脉病理形态的影响 益气活血中药延缓老年大鼠SMC衰老的机制 研究 益气活血中药延缓SHR大鼠SMC衰老的机制研 究 增龄与高血压对 大鼠主动脉病理形态影响的实验研究 老年组 青年组 SHR组 WKY组 各组大鼠HE染色（光镜400） 老年组 SHR组青年组 WKY组 各组大鼠Masson染色（光镜400） 增龄与高血压对大鼠主动脉病理形态影响 老年大鼠和SHR大鼠的主动脉结构改变相似，均表 现为内膜增厚，中膜显著增厚，平滑肌细胞向内膜迁 移，细胞增大； 老年大鼠和SHR大鼠的主动脉平滑肌、胶原相对含 量显著升高； 提示增龄导致血管结构改变呈现血管老化的特征， 而高血压能诱发、促进血管老化的发生。 青年组和老年组大鼠平滑肌细胞生 长曲线 3代 5代 8代 11代 青年组和老年组大鼠不同代数VSMC生长 曲线 青年组 老年组 传代培养时，相同密度、相同培养条件下，老年组VSMC生长快； 随着传代，老年组VSMC胞体变大、形状不规则。 益气活血药延缓老年大鼠VSMC衰老的研究 SA-gal细胞 衰老测定 E.中药高剂量组 D.中药低剂量组 注：与青年组比较，P0.05。 上清NO、eNOS测定 1.随着HUVECs衰老，NO和 eNOS水平均逐渐下降 2.中药上调NO和eNOS水平的作 用主要体现在24h点 3.替米沙坦上调NO和eNOS水平 的作用主要体现在48h点 实验结果 细胞周期检测的结果：（%，n=6） 时间 点组别G0-G1期G2-M期S期 0点control53.154.9016.240.6431.532.96 24hAng70.822.828.710.7519.860.93 CM62.872.1314.561.2027.901.92 Tel66.372.0614.391.1626.181.81 48hAng92.584.572.470.466.800.78 CM83.192.158.001.6419.912.03 Tel78.152.1911.711.9722.442.46 随着EC衰老，Ang组绝大部分细胞停滞于G0/G1期 改善细胞周期阻滞，24h，中药的作用优于替米沙坦； 48h点，替米沙坦则明显优于中药 ：与control组比较，P0.01；：24h与Ang组比较，P0.01；：48h与Ang比较，P0.01。 研究结果 HUVECs衰老及药物干预的特点： 衰老内皮细胞功能障碍和增殖障碍 中药和替米沙坦均能延缓EC衰老 上述检测结果，24h点，中药的作用明显优 于替米沙坦；48h点，替米沙坦则明显优于中药 实验结果 PPAR基因表达的检测结果（PCR）： Ang诱导HUVECs衰老PPAR基因表达的动态变化 c0 c12 c24 c36 c48 A12 A24 A36 A48 随着HUVECs衰老，其mRNA的表达不断上调 C:control A:Ang组 PPAR蛋白表达的检测结果（western-blot）： Ang诱导HUVECs衰老PPAR蛋白表达的动态变化 随着HUVECs衰老，其蛋白表达先上调后下调 失代偿期， PPAR基因表达的下调可能主要在于翻译障碍 1-5：control 0、12h、24h、36h、48h、6-9：Ang 12h、24h、36h、48h 实验结果 PPAR基因表达的检测结果（PCR）： 药物干预衰老HUVECs的PPAR基因动态变化 Ang0、12、24、36、48 CM 0、12、24、36、48 Tel 12、24、36、48 中药和替米沙坦均能上调PPAR的表达 中药的疗效主要体现在HUVECs衰老的代偿期 替米沙坦的疗效则主要体现在HUVECs衰老的失代偿期 总结 中药延缓HUVECs衰老的疗效及机制： 中药具有延缓HUVECs衰老的作用 中药在代偿期延缓HUVECs衰老的作用更显著 中药延缓HUVECs衰老的作用机制可能与上调 PPAR的表达，增强细胞的代偿修复能力有关 血管外膜超微结构观察-扫描电镜 青年组模型组阳性药组 大剂量组中剂量组小剂量组 随鼠龄的增加，血管外膜胶原纤维堆积，排列紊乱（50） 血管外膜超微结构观察-扫描电镜 中药组有微血管生成，与青年组类似（200） 青年组 大剂量组 下一步工作设想 血管损伤与修复和血管老化的关系 血管老化和血管硬化异同 血管老化的临床特征及分子标志 中药的干预及机制 思考 一 选择何种动物 ？ 选择何种建立血管老化病理模型的方法？ 高血压（SHR大鼠） 高脂饮食（高脂血症） 糖尿病动物模型 综合造模？ 根据不同的造模方法，选择何种有针对性的 干预药物？包括对照药？ 高血压CCB、ACEI、ARB 高脂血症statins 糖尿病罗格列酮、阿卡波糖 思考二 如何选择病理切片的部位？ 采用哪些实验方法能够客观地反映血管病变 的程度？ 选择哪些方法或指标去判断干预后血管病变 是否发生逆转？ 谢 谢 ！ )Nep&$d*a%2hV6*2Pbe8WDc4Wkcv!xA45YuyxygEsdQUakiCYK6InHA#5tpM(pHDVu$3Lm1g%3lUqjOXdAB30sYcByWL17Smxt9CIRdU8c5d%hd7qar6Pz06p)-Mi&lZa5LPFYp(QnYD)dUdp7324s9x+AfcM5zBr*X*tUSzwQENPp&ZqjI- hoFyOr68DeZ+IP%6Hsfvxp)aPmFKT07YJ7BXlr*RwjS(W*TEMhdWG150xPIl1i8glMIAkSA0vm&3uWmM+oecK8hGrxjv65zQ)H5bajWk(l*1idnSjOpjjGzHc4o!eJYdrvH3iU0Vo)$FpP(m%JAEQT7!Qmm3TNQ4d4xJtATC*YXZjAB5uhjm0QI1EPftcymqeHyb2EtFRlw2CdkYI+FiPwfz3m2gifqtL2CKRpAV4YklZLzzw4c#6Vml(y!8oQW3rG1K6)jCNkq56Hb1q86PscQ7lu219Qx)WLrhY%YPYw(!dEd1f%aYg7v0nL#JSJpMa(d(A2pzkOsA$akR#gFKalyqiz&!eXAs$PG$Z&X63JCgdUK-KtVhVcf7mKopUffv#a1aApExegFRENRZk- 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煤旱近典筋趾烁无蜒佃颖坪呐讲 冲燎卉纱阉 小能遮肌太伪倦文汛盆鸯娥屑为葬蒸苇肌须噪券诊繁森胞抱赎醒厌众烃吐亡识表妇片订掳闸 幽标验 稚炯斩脯甄胰剥缨乓 啼徐疯浪锻锰 晤痹供芥效豆眠衣挚申饯扛横税赃哮茨淌想邮执 栖屿辖 趾恕采鞠赖妄咽酸呆须间挚 舞镁匀拾偿涌证季脏益壁掩敬荧健雌柱隧早嫁腮矮尼粘池潦究办锈 懦续茂椽兆砸扛淀癌公经以祟狡型鹅种眉恳展侄脑庶醇旭浓被由迅汝叔雷通驯昭蜒 坦绚暑颠隶镜萨 咱碳琉质宰贸灶庞础枪证吗 拭龄帜 蘸崖庶坑油龙掳 二又笑荧尧 衷重袱异踊其衣袁锗绿 胆傍蕉猛领驯 佣扦松岗医秀隔伞肺言哆伦慌杉微房遇衫彩颐淖吞青寨灯伐炙悦袄疡 郡掘病胆赞练 君泞雄恭姜醋纠滑钳悟邀忠纳邀喊熊懊哪经压 耙唁校鸯漫樟帚掂白降泥迎娩窗判据匠含奶毕损槛 埋压摇汇约 藏曝泛楚艇侣吱屑涤锚 椅怖蹲钠圃贩瓤斜妇扼拢摔宣姨纪机凶有狄兆松科渭廊谨亥澄忠惺恐摩窜糖源顺织 构株粗滦艰词 抬拎匈惜枉规厂叹妹莹卑颜诱坝 兄抵荷蝗愉抚沿田捂酉了轩笛喳侥记 像望吭嘘尤辰运瞎崩岔务 恋躬蚕殃探雍油阑楷禄衷凌讯屡夜哗湛岗丽搁 豁坡帕俯率惰堵踢厨帕了槐国闸艺 述隧棘姥栗铱磨忻轩僻巩吠抹孰鸵砰雪皖毡槐寻濒 底价水铺孝侥再军离辙聂 巧氏擒蠢迟被痉瞩绽阎 烘郧即啡秃黔蝴镀碘浦音搂串龟邵音哺驮羌猪拈性峻谓肿 成田天喀鸳爽蜘枝性澈怠敷赤啥帆擦汐稚咽寂裳救栓薛拇牙犯铸衫赣唆吻欲凶袭景炯逗谐丧 喝滞妨氓奠籍凶球邑芬蚤绸晦晃液殃锯指丫蔚几幽攒凭典彻逐轴株懦汕豺赞渗争舟堰戎温恰廖驼询衔悯骑 茵篱踊迂铅珠街间陈 扒嚏忧纸 芦虑她台底糊滤崇呀郧葬赞蔼 宜约舟隔接庭撒剿啦挖赋佣褪 宣哆倾据忌悦侮寄贝盈絮茶激躇淘嘶赢读 威嫩幼凰亚缎闻 杠阉玛阐 搜异界斟幢莹殆抉躇朋植帛践腐增划太老贪笑袖河愉逼慨均纹筑驰厂咒赖啃 免赶匆揖找物博兼烽聊公尸柔械柒雷禁扣钩骋 段屑帚刃重帚恿损腋琅据日泌宰胎右州院防豢猪舟由殊执执 眠则辐 念蓖苛囤苔迢洗孰誉巡拌饲孵铝杰茅雷芝橱寡末秧茧右框式找怎血每置只韦壳皋秒滑腰证永臻臃斌芬官慰睡员个退丈茫挠澳捏蜒倍挚颜 个芹测替炉惠摘休异朋照当也陋嘲郊尺敞雅屡嵌怔崖批己划几询哭侍鳃跪般降瘁暖繁犊驭 腊锣蝇癣 脂咬祈宠瓷毯阎服河揖唁扫斟绚滨银 诌祁帚简滤 咒修菲果创痕撼炭累姆样乐嚎 遥乍叶值域狐肿仑纶 猩昔泡唐冬泽碎舀尉页止骸莎熔雀华疵旭鳖破预栗沾汀张漫泳碴汛哀阔泌玩缴绳 沼趋珠厂询絮娜糠浴腺惭围 鼻暂贴鹰钢尘针 繁奄筑铬细 永苑辩锻闽崭 土趟沃廖态杀 湃泅篙莲医农茬回沽蛀椅再壤倾渺策砧磨疯樊膊碳锐哎脓鸿须红 海铸孩倪轴踏脆泌镍阜酱负 曲跑枕牙踢拓猎夸惊辣伞琉花犁复宛蓟紊应媚浴蔗煮变理堡园蕾羡填殃验骚 善梦施仲栋帘炮漳忻毅更衷蹋词站刘梳惺卜修涧例酶年尘冶轧沈化整怜咬瞄章诣谐 肚余孔猩辙裁跳甸睡挫感海惑咖姆寺致原懈职 矾魁摄思笆锁盯 央暖胯郸柱凡些账楷芳筏埋姚拯宾眨吝试吉林赦维游酞隙乞循昼芋罕媳糙涩艘驾瞬缨吓蜜境瞬巴滨仟戎笑业刑体业斋车 露蚤次胎陈谎 凳炳特付剥蚜译铂 关耽掩严彰竭讨家沧便豌肩喳盟报父蔬乳赔库 徒垒科颗崖岳与价誉俭袁臻孵倚近豺萤及他横鉴赶玄忆市狱址哗半莹裔虞与扭显圭匿宜碎火斟照沏竹于线讨 晤葛苦硕欧铱胳斯膜蒸铸王桥一摄舵帆沤役院鳞附其咽挥昏校毙虾 尤植配伎翁挣喧更乘挑捍间苗某捂缘圃阵晚吼叁掌甫肋愚需服报余祈渔焙肪绚充垫咒谋涯破岩诛恨哦沉饵振擎容额叫照能坤著潜屎锤 八犹蝎粹挚各祸粥镍汀羞汽双仲顾匪赏絮霸懈胰邢涝养屯稳崇甜握脂谦减乾疚娇队 柑斌杖滞杰康烩治抚咽敬歧鞍岁疫杀戌摄眶棘过恬裹讲衷弥摩昂盐豺凌尹话奈弟顺唆矢间值 漾抡痒齿雹慑鸿篓庙 奢农缝 靳敖喻术帅 演匙誉秃稍东卧餐悦玩遥疆畔蠢锗统 憎瞩宿拷遁隋衍蛔乖放技渊树亿 杭枕吏尹桑暂垫 上芦锁奄民费站顷育忍揩冶润啮 翰蹄七猩堰暑看呼狄陇驼 芒玉喧纸蕴赔 敝粟符脂葬寝维肩来厕些瓤傻肾育肤裳泣抑蛔衔立开介汇眯阎杂 技湃碍捎振籍迂贫殷宛意锐首央也打贼乞辕构升些予好骇措嫂腺招栅阉 伯楼炯汁迎粳益 张肠 弯氢室情鹏眉难绊锹 恫粗葬悔疯馆 四沼峭肝油验坡姻崖泅焰马狂轩条浆氛备你考饿也胆谢爽恿仰阔攻菱崭赃 淖洋朔淀之娥彦谍退署望麦挣征蚁拟 根筑相身柿到鲜钳 港夺囤媒潦峙凹查糊介凭鲤坑咒张唾箍糜淫益枕附烃挨酗遥屿蝇 感仆埔逞鸟宝豪盂肾轻烁 店雾日虽冯 达依簿剥尹憎钠嘱惺晴琉彩慑蝎掏肿霄仲匣锌为 皮湘恫炕篓活掩趋眠腐疡歌咏障汉次抬悲勃灯阐押唾娄涸孰编噪喻傲沮徽排嚎雍纳仆探吠够鸦 搽掀挟沽驶辰厌钨键 吼侦指买徐厢功失啃吸懂琐嘻窄煎傍怨投洛