兔子免疫血清和无免疫血清.ppt

兔子免疫血清和无免疫 血清 成分分析比较 作者：钟园园、郑晓阳 目录 v前言 v材料、仪器设备与方法 v结果分析 v讨论与总结 前言 血清是血浆中不含纤维蛋白原的胶状液体,具有 维持血液的正常粘度、酸碱度、渗透压等作用。它 主要由水和各种化学成分组成,这些化学成分包括白 蛋白、1 、2 、- 球蛋白,甘油三酯,总胆固醇, 谷丙转氨酶等。动物在生命活动过程中常常会受到 病原微生物的侵袭而发病甚至死亡。为了防止动物 发生传染性疾病,所以常常对其进行免疫接种。动物 获得免疫能力对自身生理有什么影响，这是一个值 得研究的方向。本实验主要是粗略地测量血清中的 成分在免疫后与无免疫中的含量变化，从宏观上把 握免疫对血清成分含量的影响。 前言 血清总胆固醇测定是血脂分析的常规项目,目前 国内大多数实验室的常用方法有酶法、硫酸一磷酸 一高铁显色法、硫酸一醋醉直接显色法、硫酸一醋 酥煮沸显色法及邻苯二甲醛一硫酸显色法和邻苯二 甲醛法等。本实验我们采用的是邻苯二甲醛法。其 在临床上的意义：血清中总胆固醇的浓度可作为脂 类代谢的指标，但脂类代谢又常与糖类及激素的代 谢密切相关，故在其他物质代谢异常时亦可影响血 清总胆固醇的浓度。 前言 血清谷丙转氨酶活力的测定为一种较好的早期 诊断肝炎的方法之一。其在临床上有重要意义：正 常时，谷丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细 胞含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释 放入血中。所以血清中此酶活力很低。当肝脏、心 肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各种酶 释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清 中此酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的 依据。本实验采用纸层析法和比色法探究动物免疫 对血清成分含量的影响。 前言 分离、纯化与鉴定球蛋白的方法很多 ，本实验用醋酸纤维素膜电泳法对蛋白质进 行量化、比较及特性鉴定，是较为经济、快 速且可重复的方法。本次血清清蛋白与-球 蛋白的分离与鉴定覆盖了传统生化技术，包 括离心技术、层析技术、分光光度法和电泳 技术。 1. 1材料来源及处理 v4号血清：由生命与环境科学学院生化试验室提供。从四只兔子分别提 取血清用于生化实验，其中有一只兔子是有免疫的，其它的是未免疫的 ，血清提取出后置于冰箱冷藏。 （血清主要由水和各种化学成分组成,这些化学成分就包括白蛋白、1 、2 、- 球蛋白,甘油三酯,总胆固醇,谷丙转氨酶。大量实验证明将 血清密封放入-10 冰箱中长时间保存,由于水分和这些化学成分没有变 化,因此新鲜血清和-10 保存一年的血清醋酸纤维素薄膜电泳后的血清 白蛋白、1 、2 、- 球蛋白的百分值无显著差异,两种血清的甘油 三酯,总胆固醇,谷丙转氨酶也无明显差异。完全能满足实验的要求。这不 仅不浪费血清,而且方便又节省实验经费）。 v猪肝：由生命与环境科学学院生化试验室提供。几天前从菜市场买来置 于冰箱里保鲜处理，到要用时取出（同上，冷藏对谷丙转氨酶影响不大 ）。 1.2 仪器与设备 v1.2.1 凝胶柱及架 v1.2.2 30、37水浴箱 v1.2.3 定时器 v1.2.4 微量进样器 v1.2.5 分光光度计 v1.2.6 透析袋 v1.2.7 电炉 v1.2.8 电子天平 v1.2.9 水浴锅 v1.2.10 离心机 v1.2.11准确的加样器 1.4 方法 v1.4.1 血清胆固醇的定量测定：邻苯二甲醛法 v1.4.2 血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定：盐析 法分离提纯蛋白质、透析法脱盐与蛋白质浓缩、凝 胶过滤层析、醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血 清清蛋白 v1.4.3 谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定： 纸层析法、分光光度法测定血清丙转氨酶的活力 结果分析 2.1.1血清总胆固醇的含量 图1血清总胆固醇标准曲线 图2 兔子血清总胆固醇含量 由图2可知免疫兔子血清中胆固醇含量比未免疫的兔子低很多 样样 品吸光度 胆固醇含 量/mg 不免疫 兔子 血清0.09837.3 免疫兔 子血 清0.0161.652 凝胶层析洗脱结果 图3 凝胶层析洗脱曲线图 由图3可知蓝色的蓝葡聚糖比黄色的重铬酸钾先流过凝胶柱，且蓝 葡聚糖在第10管，即约流出197ml时,达到溶质数最大,即浓度最大；重 铬酸钾在第24管，即约流出473ml时达到溶质数最大 全血清、清蛋白和-球蛋白 电泳结果 纯化的-球蛋白样品为一条带 （-球蛋白位置），正常兔子血 清样品为五条带（清蛋白、1、 2、及-球蛋白） 上清液的迁移距离=2.50cm -球蛋白的迁移距离=1.57cm 全血清中： -球蛋白的迁移距离=1.52cm -球蛋白的迁移距离=2.10cm -球蛋白的迁移距离=2.50cm 上清液的迁移距离 =2.78cm 图4 全血清、清蛋白和-球蛋白电泳 谱图 兔子血清中谷丙转氨酶的活力单位测 定 图5 A520nm下酶活力单位的标准曲线 对对照未免疫兔子4号免疫兔子 分光度00.0850.112 GPT单单位（100ml）066.1196.11 由右表可知免疫 兔子血清中酶活 力单位比未免疫 的大 图6 纸层析结果图 22讨论与总结 血清成分的变化能够对血液质量产生重 要影响。因而对血清成分的分析具有非常重 要的意义。本实验通过邻苯二甲醛法定量测 定血清胆固醇的含量,血清清蛋白与-球蛋白 的分离与鉴定,血清谷丙转氨酶活性的鉴定及 活力测定,对兔子血清的成分进行分析。 血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法） 本实验采用邻苯二甲醛法，操作简便，即无须将样 品中的胆固醇提取出来或除去样品中的蛋白质，灵敏、 稳定。在实验中，应注意几个事项，如硫酸含量的高低 对显色有影响，故混合酸的配制和测定过程中的加量应 非常准确；加好溶液混合完毕要静置10minutes左右,使 更好的混合等等。胆固醇是细胞膜的重要成分，人体内 90的胆同醇存在于细胞中，如果没有胆固醇，细胞就 会死亡；胆固醇还是人体内许多重要生物活性物质的合 成材料，如胆汁、性激素(如睾酮、雌二醇)、肾上腺素( 如皮质醇)和维生素D3等。本实验得出免疫兔子血清中 胆固醇含量比未免疫的兔子低很多，原因可能是免疫影 响了胆汁、性激素、肾上激素等的含量，进而影响血清 中胆固醇的含量，这需进一步研究。 血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定 通过本实验测定，免疫兔子血清中酶活力单位比未免 疫的大。可能的原因是免疫的兔子本身发生病变或者 是免疫使兔子的细胞膜通透性增高，从而引起血清中 谷丙转氨酶活性提高，具体原因需进一步研究。 本实验误差来来源可能为：将测定管和对照管置于水 浴中与二硝基苯肼作用20分钟过程中反应未完全。氢 氧化钠的加入量不够准确,这道接影响对照管的光密度 , 使酶的活力出现偏高。与显色剂反应的温度未能控 制好。这时, 对照管光密度偏低,而测定管从“ 水浴中 取出后, 管内温度仍高于室温, 反应可能接近完全, 因 此测得的酶活力偏高。 血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定 分离蛋白质需要经过很多步骤，这要求实验中 要做好每一步，如盐析、透析等等。在洗脱步骤中 用蓝葡聚糖和重铬酸钾代替蛋白质通过凝胶柱,由结 果知蓝色的蓝葡聚糖比黄色的重铬酸钾先流过凝胶 柱，说明蓝葡聚糖的分子量比重铬酸钾大。 在纤维素薄膜电泳中, 纯化的-球蛋白样品为一条带 ,正常兔子全血清样品为五条带（清蛋白、1、2 、及-球蛋白）。由于实验误差较大，因此全血清 中的-球蛋白和清蛋白的迁移距离和纯化的-球蛋 白和清蛋白相差很大。但是通过鉴定也使我们了解 血清中蛋白质的种类。 参考文献 v1中级医刊2：107，1962 v2 林书. 影响血清转氨酶活力测定因素的探讨. 福州市传染 病院,1978, (9):407-410 v3 黄天锡. 那些疾病和原因出现转氨酶增高. 右江民族医学 院附院,1998:35-37 v4 叶晓健，田纪伟，高岱峰，李家顺，贾连顺，赵书平. 脊 髓半切伤大鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性变化的研究. 中国临床康复,2004,8(17) :3282-3283 v5 董宁池,潘雪峨,金润昭,郭旭芹,张兴. 五种血清总胆