（动物遗传育种与繁殖专业论文）生长抑素基因工程天然及免疫鼠源单链抗体库构建研究.pdf

生长抑素基因工程天然及免疫鼠源单链抗体库构建研究 摘要 噬菌体抗体库技术是继单克隆抗体制备技术后具有换代地位的抗体制备技术， 在功能蛋白的表达、疾病诊断和治疗等领域具有广泛的应用前景。生长抑素( s s ) 是由下丘脑分泌的一种神经多肽，通过抑制生长激素释放而抑制动物生长和泌乳， 是重要的内分泌激素。因此，建立s s 免疫测定方法和免疫芯片技术对于研究动物生 长和泌乳调控机制、开发促进动物生长发育和泌乳的新技术等，均具有重要意义。 迄今，国内外关于小分子单链抗体的研究鲜见报道，至今无应用噬菌体展示技术筛 选生长抑素单链重组抗体的报道。 本研究取健康b a l b c 小鼠脾脏和用偶联牛血清白蛋白的s s 免疫小鼠脾脏， 分别提取总r n a ，扩增抗体轻链和重链可变区基因，组装成单链抗体基因。借助噬 菌体展示技术，平行建立天然和免疫鼠源单链抗体库。主要结果如下： 1 人工抗原的合成及免疫：将设计合成的生长抑素利用碳化二亚胺法与b s a 偶 联，制各人工抗原。免疫b a | b c 小鼠，其抗血清效价最高可达l ：2 5 6 0 。 2 抗体可变区基因的获得及目的基因构建：分别取未免疫的和抗血清效价较高的 小鼠脾脏提取总r n a ，用r t - p c r 分别扩增得到抗体重链可变区( v h ) 和轻链可变 区( v l ) 基因，大小分别为3 6 0 b p 和3 4 0 b p 左右；纯化回收的v h 与v l 基因在接近 等摩尔浓度下连接。在免疫库构建中采用含有l i n k e r 接头片段的引物，利用重叠延 伸p c r 法( s o e p c r ) 将v h 与v l 基因片段拼接起来，再用带有限制性内切酶位 点的引物扩增出单链抗体( s c f v ) 基因片段；在天然库构建中采用不对称p c r 连接 单链抗体( s c f v ) 基因片段，分别获得大小约7 5 0 b p 的目的片段。结果表明，不对 称p c r 连接方法的效率高于传统的组装方法。 3 s c f v 噬菌体抗体库构建：s c f v 基因纯化后经跏i 和n o t i 双酶切，与同样经过 双酶切的载体p c a n t a b 5 e 连接，电穿孔法转化大肠杆菌t g l 感受态细胞，提取质 粒，经p c r 初步鉴定证明有外源片段插入且与目的片段一致。转化菌经辅助噬菌体 m 1 3 k 0 7 超感染后，收集上清，得到噬菌体抗体库。天然库的构建中，经过4 0 次电 击，获得了9 8 1 07 抗体库，相对于免疫抗体库的3 条片段s o e 连接法，5 次电击 获得的9 3 1 0 7 抗体库，后者的效率要高的多。可以看出，免疫抗体库构建的工作 量远远低于天然库。 该抗体库的建立，为进一步筛选和表达抗体、建立生长抑素放射免疫测定、酶 免疫测定、免疫组化分析和免疫芯片等技术奠定了基础。 关键词：生长抑素单链抗体噬菌体抗体库 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 a b s t r a c t p h a g ed i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r yt e c h n o l o g yh a sb e e nw i d e l yu s e di nt h ed i a g n o s i sa n d t r e a t m e n to fd i s e a s e ，a n df u n c t i o n a lp r o t e i ne x p r e s s i o n ，w h i c hg a v ei tab r i g h tp r o s p e c ti n t h ed e v e l o p m e n to fi m m u n o a s s a y s o m a t o s t a t i n ( s s ) c o n s i s t i n go f1 4a m i n oa c i dr e s i d e si s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n tn e u r o p e p t i d e ss e c r e t e df r o mh y p o t h a l a m u sn u c l e u s ，w h i c h i n h i b i t st h es e c r e t i o no fg r o w t hh o r m o n e ( g h ) a n dr e s u l t si nd e p r e s s i o no ft h eg r o w t h a n dl a c t a t i o n s sh a sb e e nc o n s i d e r e dak e ye n d o c r i n eh o r m o n ei np h y s i o l o g i c a l r e g u l a t i o no fa n i m a l sp r o d u c e df o rm e a ta n dm i l kp u r p o s e t h e r e f o r e ，i ti si m p o r t a n tt o e s t a b l i s ht h ei m m u n o a s s a ym e t h o d sa n dt e c h n i q u e sf o rs t u d yo nt h eg r o w t hr e g u l a t i o n m e c h a n i s m ，a n df o rd e v e l o p m e n to fn e wt e c h n i q u e st op r o m o t eg r o w t ha n dl a c t a t i o n t h e r eh a v e b e e nf e wr e p o r t sa b o u tm i c r o m o l e c u l e s i n g l e c h a i nr e c o m b i n a t i o n m o n o c l o n a la n t i b o d i e ss of a r f u r t h e r m o r e ，t h e r eh a v e b e e nr i or e p o r t sa b o u ts e l e c t i o no f s c f v sa g a i n s ts o m a t o s t a t i nb yp h a g ed i s p l a y , t o o s sw a sc o u p l e dw i t hb o v i n es e r u ma l b i u m ( b s a ) t oo b t a i n 觚a r t i f i c i a ls sa n t i g e n w h i c hw a su s e dt oi m m u n i z e dm i c e s p l e e n sw e r eo b t a i n e df r o mb o t hn o n i m m u n i z e d a n da r t i f i c i a l l yi m m u n i z e dm i c ea n du s e dt oe x t r a c ta n dp u r i f yr n ar e s p e c t i v e l y t w o s o u r c e so fr n aw e r eu s e dt oa m p l i f ya n t i b o d yg e n e sf o rt h en a t u r a la n di m m u n el i b r a r y r e s p e c t i v e l y t w os c f vl i b r a r i e sw e r ec o n s t r u c t e dv i ap h a g ed i s p l a yt e c h n i q u ew i t ht w o s o u r c e so fr n a t h em a i nr e s u l t sa l es h o w na sf o l l o w s ： 1 i m m u n o g e ns y n t h e s i sa n da n i m a li m m u n i z a t i o n t h eh a p t e ns o m a t o s t a t i nw a s c o u p l e dw i t hb s a t om a k eac o m p l e t ea n t i g e ns s - b s ab yt h ec a r b o d i i m i d ea c t i v a t i o n t h eb a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e dw i t hs s b s as e v e r a lt i m e su n t i lt h et i t e ro fa n t i b o d i e s r e a c h e dt o1 2 5 6 0 2 t h eo b t a i n n i n ga n ds p l i c i n go fi m m u n o g l o b u l i nv a r i a b l eg e n e s t h ec o m p l e t er n a w a se x t r a c t e df r o ms p l e e nc e l l so fn o n - i m m u n i z e dm i c ea n dt h ei m m u n i z e dm i c ew i t ht h e h i g h e s ta n t i b o d yt i t e r s u s i n gt h er t - p c r ，i m m u n o g l o b u l i nv a r i a b l eh e a v y c h a i nr e g i o n g e n e s ( v i i ) a n d v a r i a b l el i g h tc h a i nr e g i o ng e n e s ( v l ) ，w h i c hw e r ea b o u t3 6 0 b pa n d 3 4 0 b pr e s p e c t i v e l y ，w e r ef i r s ta m p l i f i e d t h ea p p r o x i m a t e l ys a m em o l eo fv ha n dv l g e n e sp u r i f i e dw e r ej o i n t e dt o g e t h e rt h r o u g hs p l i c i n gb yo v e r l a pe x t e n s i o n ( s o e ) ，u s i n g t h ef r a g m e n t sc o n t a i n i n gp a r t so ft h el i n k e ri ni m m u n es i n g l ec h a i na n t i b o d yl i b r a r y c o n s t r u c t i o n t h es i n g l es t r a n dd n aw a sa m p l i f i e dv i aa s y m m e t r yp c rf o rn a t u r a ls i n g l e c h a i na n t i b o d yl i b r a r yc o n s t r u c t i o n t h es i n g l ec h a i nf r a g m e n tv a r i a b l eg e n e sw e r ea b o u t 7 5 0 b pg e n e r a t e db yp e r ，u s i n gt h ep r i m e r st h a tc o n t a i nt h es l i c es i t e so fr e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ea s y m m e t r yp e ri sb e t t e rt h a nt h et r a d i t i o n a r y l i 生长抑素基因工程天然及免疫鼠源单链抗体库构建研究 l i g a t e dm e t h o d 3 t h ec o n s t r u c t i o no fs c f vp h a g ed i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r y a f t e rd i g e s t i n gw i t hs f i i a n dn o d ，t h es c f vg e n ef r a g m e n t sw a sl i g a t e dw i t ht h ep h a g ev e c t o rp c a n t a b 5 ea n d t r a n s f o r m e di n t oc o m p e t e n te c o l i t g1c e l l sv i ae l e c t r o p o r a t i o n p l a s m i de l e c t r o p h o r e s i s s h o w e dt h a tt h ei n s e r t i n gf r a g m e n t sa n dt h ea i m e df r a g m e n t sw e r ea m p l i f i e du s i n g p c r t h et r a n s f o r m e db a c t e r i u mw e r ei n f e c t e dw i t hh e l p e rp h a g em 13k 0 7 a f t e r s e d i m e n t i n gt h ec e l l ，c o l l e c t e dt h e s u p e r n a t a n t t h e nt h ep h a g ed i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r y h a db e e ns u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d t h en a t u r a ls i n g l ec h a i na n t i b o d yl i b r a r yc o n t a i n e d 9 8 x1 0 7 i n d e p e n d e n tc l o n e sa f t e rf o r t yt i m e so fe l e c t r o p o r a t i o n ，t h ei m m u n es i n g l ec h a i n a n t i b o d yl i b r a r yc o n t a i n e d9 3x10 7 i n d e p e n d e n tc l o n e sa f t e rf i v et i m e so fe l e c t r o p o r a t i o n i ti sc l e a rt h a tt h el a t t e rm e t h o di sm o r ee f f i c i e n c yt h a nt h ef o r m e r ，t h ej o bt oc o n s t r u c t e t h ei m m u n ea n t i b o d yi sl e s st h a nt h en a t u r a lo n e i naw o r d ，w et a k es o m em e t h o di nr e s e a r c h i n gs i n g l ec h a i na n t i b o d yb yc o n s t r u c i n g s c f vp h a g el i b r a r y , w h i c hi sa b l et ob eu s e di ns e tu po fr a d i o a c t i v ei m m u n o a s s a y m e t h o d s ， e n z y m e - i m m u n o a s s a y m e t h o d s ， i m m u n o h i s t o e h e m i s t r ya s s a y s a n d i m m u n o a e h i pa g a i n s ts o m a t o s t a t i ni nt h ef u t u r e k e y w o r d s ： s o m a t o s t a t i n p h a g ed i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r ys i n g l e c h a i nv a r i a b l e f r a g m e n t s ( s c f v ) i i i 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 a b a g a m p b p b s a e b e d t a e l i s a f a b g h h r p k a n o d p b s p c r s c f v s s v a v l a n t i b o d y a n t i g e n a m p i c i l l i n b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ea c i d 抗体 抗原 氨苄青霉素 碱基对 牛血清白蛋白 溴化乙锭 乙二氨四乙酸 e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附试验 f r a g m e n tw i t ha n t i g e nb i n d i n g 抗原结合片段 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e辣根过氧化物酶 k a n a m y c i n o p t i c a ld e n s i t y 卡那霉素 光密度值 p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e磷酸盐缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 s i n g l ec h a i nv a r i a b l ef r a g m e n t a n t i b o d y s o m a t o s t a t i n 单链抗体 生长抑素 v a r i a b l er e g i o no fh e a v yc h a i n 重链可变区 v a r i a b l er e g i o no fl i g h tc h a i n 轻链可变区 i v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密舀 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特另0 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：涨赧 时间： z o o g # -6 月1 5 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定一，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，o f - 提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文储签名：张巍锄签名：锄勿、1 日 签名日期：】d 0 3 年月心日 签名日期：2 9 略年月心日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 生长抑素基冈工程天然及免疫鼠源单链抗体库构建研究 1 文献综述 1 1 抗体技术的发展 抗体的试验研究始于十九世纪末，至今已有一百多年历史。分子生物学及分子 免疫学的发展极大地促进了抗体技术的研究。抗体技术是当代生物学及医学的前沿 技术，是分子免疫学和分子生物学中发展最快的一个领域( b e t t e re ta l ，1 9 9 8 ；r a d e r a n db a r b a s ，1 9 9 7 ；c a b i l l ye ta l ，1 9 8 4 ；l u oe ta l ，1 9 9 5 ：p o l y a ke ta l ，1 9 9 4 ；m c e a f f e r t y e ta l ，1 9 9 0 ；s c o ta n ds m i m ，1 9 9 0 ) 。抗体技术领域的发展大致分为三个阶段：从 1 8 8 8 年r o u x 及y e r s i n 发现白喉毒素开始，抗体与抗原的免疫反应相继进入不同层 次的实验研究及其应用。传统的抗体都是用抗原按一定程序直接免疫试验动物后获 得的抗血清。由于抗血清中的抗体是不同的抗原决定簇刺激不同的b 淋巴细胞克隆 产生的抗体混合物，所以称为多克隆抗体( p o l y c l o n a la n t i b o d y ，p c a b ) ，为第一代 抗体。1 9 7 5 年，k o h l e r 和m i l s t e i n ( p o p k o va n dr a d e r ，2 0 0 4 ) 应用脾细胞与骨髓瘤 细胞融合，即杂交瘤技术获得只针对一种抗原决定簇的单克隆抗体( m o n o c l o n a l a n t i b o d y ，m a b ) ，成为生命科学划时代的伟大进展之一，也称为第二代抗体。2 0 世纪8 0 年代，随着分子生物学、分子免疫学的飞速发展，编码基因及抗体多样性 产生机理的阐明，抗体基因结构及功能的研究成果与重组d n a 技术结合，采用基 因工程等手段进一步研究抗体的结构与功能的关系，并对抗体基因进行改造和重组 等，产生了基因工程抗体技术( g e n e t i ce n g i n e e r i n ga n t i b o d y ，g e a b ) ，即第三代抗 体。 1 1 1 多克隆抗体 1 8 8 8 年，r o u x 和y e r s i n 研究白喉发病机理时，发现白喉菌能产生外毒素。在 此基础上，德国人b e h r i n g 和日本学者k i t a s a t o 于1 8 9 0 年将白喉外毒素注射给动物， 发现该动物血清中存在一种能中和白喉外毒素的物质，即为抗毒素。他们将具有抗 毒素的免疫血清注入正常动物体内，可使后者同样对白喉毒素具有抵抗力。以同样 的方法，他们用这种免疫血清成功地治愈了一个患白喉病的患者。这是首次用人工 被动免疫的方法治疗疾病的病例，由此开创了人工被动免疫治疗的方法而荣获1 9 0 1 年诺贝尔奖。多克隆抗体制备过程简单，生产成本低，无需特殊的仪器设备，所以 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 目前仍是众多实验室制备抗体的首选方法。但是具有特异性不强、效价低、数量有 限、动物个体差异大、难以重复制备、不利于批量生产等固有缺陷。 1 1 2 单克隆抗体 1 9 7 5 年，英国剑桥大学分子生物学研究室的k o h l e r 和m i l s t e i n 合作发表了一篇 题为“分泌预定特异性抗体的融合细胞的持续培养 的著名论文，建立了杂交瘤技 术。由于他们的卓越贡献与丹麦人耶纳共获1 9 8 4 年诺贝尔生理学和医学奖。他们 将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与经过绵羊红细胞( s h e e pr e db l o o dc e l l ， s i m c ) 免疫小鼠脾细胞在体外进行融合，发现部分融合形成的杂交细胞既能在体 外培养中无限地快速增殖，又能分泌抗s r b c 抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤 ( h y b r i d o m a ) 。这种杂交瘤细胞即具有骨髓瘤细胞能够大量无限地快速增殖的特性， 又具有持续地分泌特异性抗体的能力，是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生 的均一性抗体，故称为单克隆抗体( m c a b ) 。只要抗原能引起小鼠的抗体应答，应 用杂交瘤技术即可获得这种抗体的单克隆抗体。单克隆抗体由于纯度均一、特异性 强、亲合性高，可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性和特异性，其应用大大 促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的准确性。单克隆抗体还可以用于对各种免疫 细胞及其他组织细胞表面分子的监测，这对免疫细胞的分离、鉴定、分类和研究各 种膜表面分子的结构与功能都具有重要意义。但是，目前绝大多数单克隆抗体是鼠 源的，作为异源蛋白，在人体内应用时会产生人抗鼠抗体( a n d e r e ra n ds c h l u m b e r g e r ， 1 9 6 5 ) ( h u m a na n t i m o u s ea n t i b o d i e s ，h a m a ) 。临床应用理想的单克隆抗体应是人 源的，但是人一人杂交瘤技术目前尚未突破，即使研制成功，还存在人一人杂交瘤 体外传代不稳定、抗体亲和力低和产量不高等问题。目前较好解决方法是研制基因 工程抗体以代替鼠源单克隆抗体用于临床。 1 1 3 基因工程抗体 1 9 8 4 年n e u b e r g e r 首次报道人一鼠嵌合体在骨髓瘤细胞中成功表达，开创了基 因工程抗体技术。基因工程抗体的产生使人们得以在基因水平上了解、改善或改造 抗体基因结构及其功能，并能在原核、真核、酵母、重组病毒等不同的表达系统中 进行抗体基因的表达调控和提高表达效率。这使得基因工程抗体的研究较传统的杂 交瘤抗体的研究有了质的突破，并显示出其重要意义和实际应用前景。 生长抑素基因工程天然及免疫鼠源单链抗体库构建研究 9 0 年代发展起来的抗体噬菌体表面展示技术是抗体工程的里程碑 ( h o o g e n b o o me ta l ，1 9 9 8 ) 。应用该技术将外源蛋白或肽段的基因克隆到丝状噬菌 体的基因组d n a 中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使该外源分子呈现 在噬菌体表面，使抗体的表型和基因型联系为一体( m a r k se ta l ，1 9 9 1 ；z s e b oe ta l ， 1 9 8 6 ) ，可利用其与固相化抗原的结合活性进行筛选并获得所需的抗体基因，利于 进一步进行基因工程改造( y o k o t ae ta l ，1 9 9 2 ) 。噬菌体抗体库技术，克服了人类不 能随意免疫的缺点，而且不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术 制备人源性抗体。该技术已成为当今世界基因工程抗体，尤其是治疗用人源基因工 程抗体的研究热点，已被广泛运用于抗各类肿瘤因子、细胞因子、自身免疫疾病因 子以及各种病原因子的研究。1 9 8 9 年英国剑桥w i n t e r 小组( w a r de ta l ，1 9 8 9 ) 率 先在n a t u r e 上发表了关于抗体库构建的文章。紧接着美国s c d p p s 研究所l e m e r 小 组( h n s ee ta l ，1 9 8 9 ) 、w i n t e r 小组( c l a c k s o ne ta l ，1 9 9 1 ) 和l e m e r 小组( k a n ge t a l ，1 9 9 1 ) 在s c i e n c e 上发表了利用噬菌体展示技术构建抗体库的文章。由于噬菌体 展示技术的不断发展和完善，尤其是多年来对噬菌体分子生物学特性深入研究所构 建的多种噬菌体载体的出现，使这一技术得到广泛的应用。1 9 9 0 年，s c o t t 、c w i r l a 和d e v l i n 三个试验小组同时报道了用丝状噬菌体f d 或m 1 3 构建的随机6 肽库( s c o t t a n ds m i t h ，1 9 9 0 ) 。同年，m c c a f f e r t y 也首次报道了利用噬菌体展示技术筛选到了 溶菌酶的单链抗体( m c c a f f e r t ye ta l ，1 9 9 0 ) 。1 9 9 4 年，m o t t i 等从随机1 5 肽库中筛 选到了h b v 病毒的特异性模拟表位；同年，f o l g o r i 等首次直接利用人h b s a g 免疫 后的抗血清对随机9 肽库进行筛选，也获得了病毒的模拟表位。1 9 9 6 年，p a s q u a l i n i 和r u o s l a h t i 第一次在动物模型体内筛选出了特异结合脑和肾的噬菌体结合肽 ( p a s q u a l i n ia n dr u o s l a h t i ，1 9 9 6 ) 。2 0 0 0 年，h y d ed e r u y s c h e r 等利用噬菌体肽库技 术筛选到了6 种酶的抑制剂( h y d ed e r u y s c h c re ta l ，2 0 0 0 ) 。同年，d e n n i s 也筛选 到了能抑制丝氨酸蛋白e 因子v i i a 活性的小肽( d e n n i se ta l ，2 0 0 0 ) 。近年来，噬 菌体抗体展示技术逐渐应用于蛋白质问相互作用的研究，新型疫苗的研制，以及药 物的开发，诊断试剂的制备等领域，尤其在肿瘤( l a n d o ne ta l ，2 0 0 4 ) 、自身免疫 性疾病( k o w a le ta l ，1 9 9 9 ) 、以及血栓性疾病( y a he ta l ，2 0 0 4 ) 等领域取得了突 破性进展，通过该技术已成功制备出多种肿瘤抗体及自身免疫抗体( s c h c f f c rc ta l ， 2 0 0 2 ) ，有力推动对这些疾病的治病机制以及相应疫苗和诊断试剂的研究工作，但 是，有关应用噬菌体抗库制备抗内分泌激素抗体的研究，尚未见报道。 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 1 2 抗体的基本结构 所有抗体含有一个共同结构( h u d s o n ，1 9 9 8 ) ，由两条完全相同的重链多肽和 两条完全相同的氢链多肽通过二硫键或非共价键连结组成。其中两条长链( 由4 2 0 个 4 5 0 个氨基酸组成) 称为重链( h e a v yc h a i n ，简称h 链) ，两条短链( 由2 1 2 - 2 1 4 个氨基酸组成) 称为轻链( 1 i g h tc h a i n ，简称l 链) 。这四条链均由可变区( v 区) 、 多样区( d 区，只有重链有) 、连接区( j 区) 和恒定区( c 区) 组成。恒定区位于 抗体多肽链的羧基端( c 端) 。氨基酸顺序随免疫抗原不同而异。免疫球蛋白结合 抗原的不同特异性，决定于轻重链可变区氨基酸的种类和顺序的不同。轻重链区v 区的配对创造了一个抗原结合位点( p a r a t o p e ) ，这个位点能够识别一个抗原表位 ( e p i t o p e ) 。大多数蛋白质抗原含有许多潜在的抗原表位。这些抗原表位可以被一 个多克隆抗体群中通过相应的大量特异性抗体所识别( k a b a ta n dw u ，1 9 9 1 ) 。根据 抗体重链恒定区氨基酸组成和抗原性不同，抗体分为i g a 、i g d 、i g e 、i g g 和i g m 五种类型，根据抗体轻链恒定区氨基酸组成与排列顺序不同，可将五类i g 的轻链分 为两个抗原型( k 和入) 。每一抗体分子中两条对称的轻链总是同型的，不是k 型 就是入型。通过轻链和重链配对，可以进一步区分抗体( c h o t h i aa n dl e s k ，1 9 8 7 ) 。 可变区位于抗体多肽链的氨基端( a m i n o t e r m i n a ln 端) 。由一个可变框架区 ( f w ) 和一个互补决定区( c d r s ) 组成，基因序列和多样性绝大部分出现在c d r s ， 而f w 相对保守。j 区和d 区( 只有重链用) 紧位于c 区下游。c d r s 和一部分f w ， 与抗原相互作用形成抗原结合位点的中心，j 区和d 区内的序列变化进一步影响位 点的确定。这些变化的蓄积作用决定一个抗体的抗原结合活性和特异性以及它的独 特性( w ue ta l ，1 9 9 3 ) 。由于第一个框架区和j 区碳端部分的d n a 序列相对保守， 那么在一特定的动物物种中克隆所有类型的抗体成为可能。用和这些保守序列杂交 的混合引物就能区分开扩增的抗体可变区基因。应用退火到这些保守序列的引物， 就能扩增和克隆所有来自小白鼠的抗体分子含有不同的蛋白区域和片段，这些蛋白 区域和片段可通过蛋白酶消化或重组技术纯化出来( c l a c k s o ne ta l ，1 9 9 1 ；k i p r i y a n o v a n dl i t t l e ，1 9 9 9 ) 。用木瓜蛋白酶将抗体分子从重链的第2 1 9 位氨基酸处切断，得到 三个片段，两个相同的为f a t ) ( f r a g m e n ta n t i g e nb i n d i n g ) 片断，由一条完整的轻链 和一条不完整的重链组成。二者通过一个链间二硫键连接形成异二聚体，是完整抗 体分子的三分之一，仅有一个抗原结合位点。f a b 片段中的重链部分称为f d 片段， 4 生长抑桊基因工程天然及免疫鼠源单链抗体库构建研究 另一个是f c ( f r g m e n tc r y s t a l l i g a b l e ) ，由连接重链的二硫键c 端侧的两条不完整的 重链所组成。连接f a b 和f c 段的区域叫铰链区( h i n g er e g i o n ) ，用胃蛋白酶将抗体 分子从重链间的二硫键c 端切断，得到了一段较大的片段f ( a b ) 2 。f a b 和f ( a b ) 2 片 段均有抗体活性，f c 段具有抗原性。两个功能性的抗原结合片段f a b 和f v ，己经 在噬菌体上克隆和呈现出来( c h e s t e re ta l ，1 9 9 4 ) 。f a b 段由完整的轻链和重链f d 段组成，二者通过一个链间二硫键连接形成异二聚体，是完整抗体分子的三分之一， 仅有一个抗原结合位点。较小的单区抗体( f v ) 仅有单独重链可变区( 由v l 和v h 组成) ，但仍保留相当程度的抗原结合能力，又称抗体最小识别单位，其亲和力低 于完整的f v 段、f a b 段，且不稳定。但由于其分子量小，在临床、工业、农业、科 研及药物设计等方面仍具有诱人的使用价值。 1 3 噬菌体展示技术 1 3 1 噬菌体展示技术的基本原理 噬菌体展示技术是以改造的噬菌体为载体，将编码外源蛋白或多肽的基因片段 插入编码噬菌体衣壳蛋白的基因区，从而将所克隆的基因与其所编码的蛋白质有机 地结合在一起，并使目的基因表达的产物展示在噬菌体表面，进而通过亲和富集法 筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性的多肽或蛋白质， 是实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术( p e r e i r ae ta l ，1 9 9 7 ) 。构建噬菌体 展示系统的噬茵体包括九噬菌体、t 4 噬菌体和丝状噬茵体( f i l a m e n t o u sp h a g e ) ，目 前应用最广泛的是丝状噬菌体展示系统。丝状噬菌体是单链d n a 病毒，p i i 和p m 分别是噬菌体颗粒的主要表面衣壳蛋白和次要衣壳蛋白( a z z a z ya n dh i g h s m i t h ， 2 0 0 2 ) 。p i i i 位于噬菌体颗粒的一端，每个颗粒约有3 个5 个拷贝，噬菌体依靠p 感染雄性大肠埃希氏菌；p v i i i 构成噬菌体颗粒的侧壁，每个颗粒约有3 0 0 0 个拷贝。 p i l l 和p v m 正是目前最常用的噬菌体融合蛋白，p m 有2 个位点可供外源d n a 插入， 即n 端和近n 端可伸屈臂类。当外源蛋白融合到p i l i 的n 端时，噬菌体仍具有感染 性。常用的p u i 展示系统是将外源序列和p i l l 基因重组于噬菌粒上，当辅助噬菌体超 感染带有噬菌粒的细菌时，完整噬菌体病毒才能被复制和包装，最终细菌释放两类 颗粒：包装噬菌粒的噬菌体和辅助噬菌体，每种颗粒表面均展示p i l l 分子和p i i i 融合 蛋白。p v m 展示系统与p 叭类似，但是噬菌体上p v i i i 递呈的外源蛋白分子数目远远 华中农业大学2 0 0 8 年硕士学位论文 多于p i i 展示系统，且形成多价抗体，而噬菌体表面却只表达3 个5 个p i l l 分子， 同时p i l i 易被蛋白水解酶水解，在辅助噬菌体超感染时，p l j i 蛋白和p m 融合蛋白的 竞争表达可以使每个噬菌体表面显示的融合蛋白平均不到1 个，形成所谓的“单价 噬菌体 ，所以实验室常采用p l l l 展示系统展示高亲和力的外源肽或蛋白。 1 3 2 噬菌体展示系统的发展 用于蛋白质或多肽展示的系统主要有3 种，即噬菌体展示系统、噬粒展示系统 和细菌细胞表面展示系统。其中，以前两种系统较为成熟，为大多数实验室采用。 构建噬菌体展示系统的噬菌体包括九噬菌体、t 4 噬菌体和丝状噬菌体。 1 ) 丝状噬菌体展示系统( f i l a m e n t o u sp h a g ed i s p l a ys y s t e m ) m 1 3 、f l 、f d 都属于丝状噬菌体，为单链d n a 病毒，其复制型d n a 常用作基 因克隆的载体。它们通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞，然后将病毒d n a 注入细菌的胞质，利用细菌胞质内的酶转变成复制型的d n a 双链，并通过滚动复 制产生子一代d n a 分子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体d n a 的结构和复制 特点，将m 1 3 或f d 作为良好的基因工程载体。因为其d n a 复制与装配不受d n a 分子的限制，因此可以将外源d n a 插入到它的一些非必需区，仅导致噬菌体颗粒 的加长，不会影响噬菌体的活性和完整性，插入的外源多肽对噬菌体的正常繁殖会 有一定的影响，可以通过使用辅助噬菌体( m 1 3 k 0 7 ) 超感染后正常进行下一轮繁 殖，通过此方法即可得到一些插入外源d n a 的基因重组体，还可以将插入的d n a 片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上，且呈现表达于噬菌体表面的外源多肽分 子能够保持其原有的空间构象及功能。 m 1 3 丝状噬菌体展示系统中虽有多种外壳蛋自被试用于噬菌体展示，目前主 要应用的是基因蛋白和基因i i i 蛋白，基因蛋白是噬菌体的主要外壳蛋白，约有 2 7 0 0 个拷贝，分子质量为5 2 k d ，由5 0 个氨基酸组成。其c 端与d n a 结合，n 端 伸出噬菌体外，较小的外源片段可与基因的n 端融合。其中央有一段疏水区，当 噬菌体在大肠杆菌细胞内增殖时所产生的基因蛋白通过这段疏水区镶嵌在细菌 内膜上，当释放时，包被在噬菌体d n a 外面。将外源蛋白的基因与基因珊融合， 就会在噬菌体表面表达出多个副本的外源蛋白。基因展示系统可用来筛选亲和力 较低的配体( s i d h ue ta l ，2 0 0 0 ) 。 基因i i i 蛋白的分子量是4 2 k d ，有4 0 6 个氨基酸残基，它的结构与基因蛋白类 6 生长抑素基因工程天然及免疫鼠源单链抗体库构建研究 似，在病毒感染的细菌内，以其靠近c 端的2 3 个氨基酸组成的穿膜区固定于内膜 上，n 端朝向质周腔。基因i i i 蛋白位于噬菌体颗粒的一端，每一个噬菌体有3 个5 个副本，其n 端l 位一1 9 8 位氨基酸能够与大肠杆菌的性菌毛结合介导噬菌体颗粒 对大肠杆菌的感染，其c 端部分则与子代噬菌体从细菌胞内释放有关。将外源基因 与基因i i i 融合，在噬菌体表面仅表达少量外源性蛋白，尤其在使用噬菌粒作为表达 载体时，噬菌体表面仅表达一个外源性蛋白分子，有利于高亲和力配体或受体的淘 选，故在构建展示文库时常使用基因i i i 蛋白为载体来筛选高亲合力的配体( w i n t e r e t a l ，1 9 9 4 ) 。 目前常用的单链噬菌体载体有表达f a b 段抗体的p c o m b 3 载体系统，是在噬菌 体载体p b l u s c r i p 的基础上由美国加州的s c r i p s 研究所构建的，已广泛用于f a b 段抗 体的表达( h u s ee ta l ，1 9 8 9 ) 。还有表达s c f v 单链抗体的p c a n t a b 5 e 载体系统， 是由英国剑桥大学蛋白质工程中心和抗体技术有限公司构建的表达s e f v 抗体的载 体系统。 2 ) t 4 噬菌体展示系统( p h a g et 4d i s p l a ys y s t e m ) t 4 噬菌体展示系统属于羧基端展示系统，目前应用最广的是将外源肽或蛋白质 与t 4 噬菌体的衣壳蛋白s o c 的c 端融合而被展示( t a n h ae ta l ，2 0 0 2 ) 。s o c 分子 量约为9 k d ，其衣壳有9 6 0