（微生物学专业论文）脱有机硫微生物的分离、鉴定及其选育.pdf

中文摘要 中文摘要 专一性微生物脱硫技术能选择地性脱除加氢脱硫技术难以脱除的芳香族含硫 化合物，是实现石油及其产品深度脱硫有效的技术之一。分离筛选优良的菌株， 选育高效的脱硫菌是提高微生物脱硫能力的重要途径。本文以此为研究目标，开 展了专一性脱硫菌株的分离鉴定、选育以及脱硫条件优化等方面的研究。 本试验从大庆油田被石油污染的土壤中分离筛选到了一株脱硫能力较高的专 一性脱硫菌h d b s 1 ，经常规生理生化鉴定及16 sr e i n a 系统发育分析，确定该茵 为坂崎肠杆菌，故将该菌命名为互汤f p 加6 口c f p rs 口施加舫fh d b s 1 。 西比，d 6 口c f p ，s 口妇勰舫fh d b s 1 经u v 诱变、d e s 诱变及u v 、d e s 复合诱变 后，得到一株脱硫能力最高的h d b s 4 。经比色法测定，诱变后菌株降解d b t 产 生2 h b p 的量达0 0 1 17 2 6 r l m l o l l ，是出发菌株量( 0 0 0 2 5 5 3 m m o l l ) 的4 5 倍多。最 佳诱变剂量为紫外照射时间为1 7 s ，d e s 诱变( 终浓度为0 3 ) 处理时间为2 5 m i n 。 将h d b s 一4 连续传代1 0 次后，遗传性状稳定。为了获得更高的脱硫力，对h d b s 一4 的培养基和脱硫条件进行了优化。通过单因子试验获得最佳培养基配方为( l ) ：甘 油10 m l ，酵母提取物2 9 ，d b t2 0 m g ，磷酸二氢钾2 4 4 9 ，磷酸氢二钠12 0 3 9 ，氯 化镁o 4 9 ，氯化锰4 m g ，氯化铁1 m g ，氯化钙0 7 5 m g ，p h 值7 0 7 5 。并确定接 种量为6 ，装液量为2 0 m l 2 5 0 m l ，3 0 ，3 0 0 r m j j l 摇床培养5 天。在最佳脱硫 条件下，培养液中2 h b p 含量可达0 0 3 5 9 l m 0 1 l ，是优化前的近3 倍，出发菌株 h d b s 1 的近1 3 倍。 关键词：砌f p 厂d 6 口d p ，s 口砌朋尼洲1 d b s 一1 ；鉴定；诱变；脱硫条件优化 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t b i o d e s u l 胁z a t i o n ( b d s ) c a l le 艉c t u a j l ys e l e c t i v e l yr e m o v et 1 1 e s u l 缸f r o m c o n d e n s e dt 王1 i o p h e n e st 1 1 a ti sr e c a l c i t r a n tt 0h y d r o d e s u l 如r i z a t i o n ( h d s ) ，a n di ti s p r o m i s i n gp r o c e s s t 1 1 a tc a j lb e c o m p l e m e n t o ra 】t e m a t i v et oh d sf o r d e e p d e s u l 凡订z a t i o no fp e t r o l e u ma n di t sp r o d u c t s t 1 1 ei s 0 1 a t i o no fs t r a i n si sp r e c o n d i t i o no f b d s t h es e l e c t i o nm u t a l l to fs 仃a i n si sa i le 肫c t i v em e t l l o dt oi m p r o v et h ea c t i v 时o f d e s u l 胁z a t i o n i n “sp 印e r ，s c r e e i l i n ga n dd e t e m l i n a i l to fm i c r o b i a ld e s u l 如r i z a t i o 玛 a n dt h ec h a r a c t e r i 鲥co fs t r a i l l t 1 1 eb i o 仃 m s f o n t l a t i o nc o n d i t i o n so fd e s u l f 试z a t i o nw e r e s t u d i e ds y s t e m a t i c a j l y as 仃a i nw a si s o i a t e df 而mp o l i u t e ds o i l so fd aq i n go i l f i e i dw i t ht 1 1 eh i g ha b i l i t y t od e s u l 觚z ed i b e 劬i o p h e n e ( d b t ) 廿1 r o u 曲t l l e4 sp a t h w l y 7 1 1 1 em o 印h o l o g i c a l p r o p e n i e sa n d16 sr c i n as e q u e n c es u g g e s t e dt h a t 吐l ei s o l a t e ds 仃a i nb e l o n g st o t h e e v o l u t i o nb r a n c ho fe n f p ，d 6 乜c f p ra n ds h o w sh i g h e s th o m o l o g yt o 至汤f e 加6 口c f e ，s o 尼口幻 t h es 仃a i nw a sn 锄e da s 上勋胞加6 口c f p ，s 口砌幻fh d b s 1 a l l i g ha b i l i t ) ，t 0d b t d e s u l f 嘶z a t i o nm u t a n th d b s - 4h 5 l sb e e na c q u i r e da 盘e rt 1 1 e u vm m a g e n e s i s ，n l ed e sm u t a g e n e s i sa i l dt l l eu v & d e sm u t a g e n e s i s t h e2 一h b p y i e l dd e t e c t e dq 咖t i t a t i v e l yb yc 0 1 0 m 甜y 、a so 0 1 17 2 6 删m o 儿，谢l i c hw a s 4 5t h e s 廿l a l lt h eo r i g m my i e l d s t h eb e s td o s a g eo fm u t a g e n e s i sw a s ：t h ei r r a d i a t i o nt i m eo f u l t r a v i o l e tw a s17 s ，c o n c e n t r a t i o no fd e sw a so 3 ，m u t a g e n i cp r o c e s s i i l gt i l l l e 、a s 2 5 m i n n eg e n e t i cc h a r a c t 嘶s t i c sw e r es t a b i 】e 蚯e rl0s u c c e s s i v eg e n e r a t i o n so f h d b s 一4 i no r d e rt og e tm 曲e ra b i l i t yo fd e s u l 如r i z a t i o n ，t h eo p t i m a ld e s u l 肺z a r t i o n c o n d i t i o n so f 玎) b s 一4h a db e e ns t u d i e d b ys i n g i ef a c t o re x p e r i m e n t s ，t h ec o n c l u s i o n w a so b t a i n e dt h a tt 1 1 eb e s ta m o u l l t s ( l ) o fd e s u l l r i z a t i o nm e d i u mw a s ：g l y c e r o l1o m l ， y e a s te x 仃a c t2 9 ，d b t 2 0 m g ，k h 2 p 0 42 4 4 9 ，n a 2 h p 0 4 12 h 2 012 0 3 ，m g c l 2 6 h 2 00 4 9 ， m n c l 2 4 h 2 04 m g ，f e c l 3 6 h 2 0l m g ，c a c l 20 7 5 m g ，p h7 0 7 5 t h eo p t i m 眦1 i i a b s t r a c t d e s u l 南d z a t i o nc o n d i t i o n sw e r et 1 1 e t 1 1 et e m p e r a t u r e3 0 ，t h ec u l t u r e s 、v e r ep e r f o m e d i n2 5 0 m ln a s k s 埘t h2 5 m l ，6 o fi n o c u l a t e dv o l 啪e u n d e rt 1 1 i sc o n d i t i o n ，t h e2 一h b p y i e l do fh d b s - 4w a s0 0 3 5 9 n 】m o l l ，w h i c hi s3t i m e st 1 1 a nu s u a lc o n d i t i o na 1 1 d 13 t i m e st l l a nt h a to f t l l eo r i g i n a ls 仃a i nh d b s 一1 k e yw o r d s ：上劢，p 厂d 施c f p ，5 口乜黝舫fh d b s 一1 ；i d e n t i f i c a t i o n ；m m a g e n e s i s ；o p t i m 啪 m 缩略语表 缩略语 h d s b d s d b t 2 h b p g i b b s d e s u v h p l c o d nn 缩略语表 英文名 h y d r o d e s u l 如r i z a t i o n b i o d e s u l f u r i z a t i o n 中文名 加氢脱硫 生物脱硫 d i b e n z o t h i o p h e n e二苯并噻吩 2 一h y d r o x y b i p h e n y l2 一羟基联苯 2 ，6 一d i c h l o r o q u i n o n e - 4 一c 1 1 l o r o i m i d e2 ，6 一二氯醌亚胺 e t h y ls u l f a t e u 1 仃a v i o l e tr a y 硫酸二乙脂 紫外线 h i 曲p e r ：f o n n a n c el i q u i dc h r o m a t o 聊h y高效液相色谱 o p t i c 出d e n s 时 、，o l u i n e 、，0 1 u l n e i 光密度 体积体积 黑龙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕴堑太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名： 确职 签字日期：7 彩年多月i 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解黑龙江大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕴堑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名： 孑翔职 签字日期：谚易年占月传日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期： 电话： 邮编： 第1 章前言 第1 章前言 石油是当今世界的重要能源，也是化学工业的主要原料，因此在每个国家的 国民经济生产中都具有举足轻重的地位。经济的发展对石油资源需求量不断增长， 而石油资源的大量使用所产生的环境污染问题，现己成为影响人类生存的重大问 题，从而引起了广泛的关注。 石油中含有的无机硫和有机硫是人类生存环境的重要污染源，其在燃烧时产 生的含硫氧化物排入大气，是形成酸雨的主要原因，对环境和生态平衡造成严重 的破坏【。据报道，我国每年约有2 5 0 0 0 h 的二氧化硫排入大气，其中大部分来自 石油产品的燃烧和精炼过程【2 】。另外，石油中的硫还会腐蚀输送管线和贮存设备， 使石油精炼的催化剂中毒，因此石油中的硫化物也是炼油工业的大敌【3 】【4 】【5 】。 石油的总含硫量在o 0 3 7 8 9 之间，除含单质硫、硫化物之外，还有硫醇、 噻吩、苯并噻吩、二苯并噻吩类及更为复杂的含硫机化合物约2 0 0 种【6 】，多年的持 续开发使得现存含硫量低的化石燃料越来越少，现在每天大约生产6 0 0 0 1 0 4 桶原 油，硫的平均含量大约为1 1 ，未来十年硫的平均含量还将继续增加【7 1 ，达到1 3 以上【8 】。随着能源危机的逐步加剧，高硫石油燃料的开发成为必然，而高硫化石燃 料必须预先经过脱硫处理才能进一步使用【9 】【1 0 1 。 1 1 石油脱硫技术研究概况 脱硫技术通常分为燃前脱硫、燃中脱硫和燃后脱硫三种【1 1 】。燃中脱硫技术目 前研究的较少，技术不成熟，有待于进一步完善；燃烧后脱硫又称烟气脱硫技术， 发达国家研究的较多，效率较高，但成本也相对较高，不适合广泛使用。当前， 国际上普遍采用的脱硫方法就是燃前脱硫技术，其效率高、成本低、适用范围广。 燃前脱硫技术主要分为物理法、化学法和生物法。 1 1 1 物理法 物理法脱硫是根据燃料颗粒与含硫化合物的比重、磁性、导电性及其悬浮性 1 黑龙江大学硕士学位论文 等物理性质的不同而发展起来的除硫的方法【1 2 】。物理法在煤炭的脱硫加工应用较 多。 1 吸附法 所谓吸附法脱硫1 1 3 】，就是利用所选用的吸附剂选择性地吸附含硫的化合物，使 之与油品相分离的一种有效的脱硫技术。该方法耗氢量少、投资成本和操作费用 低，已经达到工业化应用。但目前该技术还存在一些问题，例如吸附剂的再生、 吸附剂对油品中芳烃等不饱和烃的吸附以及脱硫机理的不明确等限制了其的广泛 应用。 2 】膜分离法 膜分离法脱硫是一种颇具特色的新型脱硫技术，它的核心是选用一种可以 选择性地通过含硫的烃类分子的专利聚合物薄膜以达到分离、提纯的目的。膜分 离脱硫工艺的分离过程主要基于分子结构类型的不同，通过膜分离的方法将硫分 子和某些烃类分子与其他的烃类分子分离| 1 5 1 。 由于膜分离脱硫不是基于油品各组分沸点的差别进行分离，在分离过程中也 没有反应发生，因此，膜分离脱硫不会造成轻、中馏分汽油中的烯烃被饱和以致 汽油的辛烷值受到损失的情况；同时，富集硫的汽油的流失率也比较小。但膜分 离法脱硫技术主要用于轻、中馏分汽油的脱硫。 1 1 2 化学法 化学法脱硫是一种较传统的脱硫方法，其原理是通过氧化剂把燃料中的硫氧 化或者把硫置换，从而达到脱硫的目的。一般在1 0 0 4 0 0 高温及一定的高压条 件下进行，化学法脱硫在原油及其转化产品的加工处理中应用较多。 1 碱洗法 一直以来，炼油厂大多都采用碱洗的办法即萃取法，来去除原油中的硫化物， 这一方法较为简单，通过碱洗可以除去原油中的绝大部分硫化物。 但此方法却能产生大量的含硫废水，若不加以妥善处理，对环境的危害会相 当严重的；此外，由于碱洗对有机硫化物的脱除率并不高，致使成品油中仍含有 第1 章前言 一些有机硫化物，影响成品油的使用价值。 2 催化法 催化法去除有机硫化合物的方法主要有以下三种：第一种，用沉积在碳纤维 或石墨纤维上的酞菁催化剂在碱性水溶液中对石油馏分进行氧化处理，可以去除 其中的硫醇1 16 】；第二种，用一个固体碱固定床和一个载体于非碱性固体上的金属 螯合剂组成的处理系统对含硫成品油进行处理f 1 7 】；第三种，在没有外加氢的条件 下，含硫成品油与酸性催化剂在流动床中接触，可使有机硫化物转化为h 2 s ，从 而可以较容易地从成品油中去除硫化物【1 7 】。 此方法的脱硫效率虽然较高，但对催化剂的投资较大、其制备条件又苛刻， 所以目前采用此方法炼油的经济效益并不高。 3 】络合法 用金属氯化物的苯二甲酸二甲酯溶液处理含硫的石油产品【18 1 ，可使有机硫化 物与金属氯化物作用，生成水溶性的络合物而加以去除。能与有机硫化物生成络 合物的金属离子很多，其中以c d c l 2 的效果最佳，但由于c d 2 + 的毒性较大，所以 经常采用c o c l 2 或n i c l 2 代替。 但络合法脱硫无法脱除油品中的酸性组分，而油品中剩余的氮化物、硫化物 可在这些酸性组分的催化作用下聚合、氧化引起安全隐患。因此工业上常采用络 合萃取与碱洗精制相结合的办法使油品的安定性达到最好。 【4 】加氢法 加氢脱硫( h y d r o d e s u l 允r i z a t i o n ，h d s ) ，即在高温高压和金属催化剂存在条件 下，将有机硫化合物转化为硫化氢再从系统中分离出来，是工业上最典型的脱硫 常用方法。近年来加氢脱硫技术取得了很大的发展，一方面改良了催化剂，另一 方面无催化剂加氢脱硫工艺的研制开发，使得过去无法处理的硫化物，如d b t 等 现在也能够比较顺利地脱除。 加氢法是相对成熟和完善并得到广泛应用的脱硫技术，但在进行深度脱硫时， 存在一定的局限性，如反应条件要求苛刻、操作费用高，导致油品生产成本上涨； 此外，加氢脱硫反应产生的副产物，例如硫化氢等气体会对造成环境造成二次污 1 黑龙江大学硕士学位论文 染需进行再处理的问题一直也没有很好的方法解决。 1 1 3 生物法 即微生物脱硫法( b i o d e s u l m r i z a t i o n ，b d s ) ，又称生物催化剂脱硫，是一种在常 温常压下利用需氧或厌氧微生物脱除石油中含硫杂环化合物中结合硫的一种新技 术。微生物菌体内的酶系可以有选择性地氧化硫原子，断开c s 键，而含硫化合 物烃类母体则继续留在油相中，油的燃烧性能并不受到影响；硫元素以水溶性的 硫酸盐形式或其它形式释放出来，或参与菌体的生物合成【1 9 1 。 与h d s 相比，b d s 最大优点是在能源工业和环境保护方面都显示出了巨大的 潜力。b d s 在常温常压下操作，能耗比h d s 低7 0 8 0 ；由于不涉及硫回收及 尾气处理，公用工程消耗也较低；采用b d s 技术的投资额约为h d s 技术的一半， 操作费用低1 0 2 5 。但是目前b d s 工业化生产技术还不很成熟。迄今为止， 尚未有厂家运用b d s 进行大规模地生产。 传统的物理和化学的脱硫方法成本巨大，而生物脱硫技术( b d s ) ，是采用脱 硫微生物降解燃料中有机硫和无机硫的一种方法，其专一性比较强，能有效脱除 传统化学法难以除去的噻吩类化合物，并保留了较高的燃烧值，且具有生产工艺 清洁无害、反应条件温和，设备简单，成本和操作费用低，为石油产品的深度脱 硫技术的广泛应用提供了广阔的前景【2 l 】。因此，近年来生物脱硫技术的研究受到 了世界各国的重视。 1 2 微生物脱硫研究进展 1 2 1 微生物脱硫研究的历史概况 微生物脱除石油中硫化物的研究始于2 0 世纪3 0 年代。早在1 9 3 5 年，就有报 道用某种硫还原菌脱除粗油中的硫。但由于当时微生物脱硫机理和技术的匮乏， 生物脱硫研究进展缓慢。直到1 9 4 8 年，第一个石油生物脱硫技术专利在美国发表， 但由于生物反应不易控制、脱硫过程需消耗大量的石油，这项技术并没有太大的 实际应用价值。 d 第1 章前言 2 0 世纪5 0 年代，生物脱硫技术的研究取得了较大进展，有关于生物脱硫的相 关专利陆续发表。但是当时b d s 的研究内容局限在筛选有效的脱硫微生物的工作 上田】，涉及的领域主要有脱硫微生物的种类及其脱硫特性方面的研究。 一 2 0 世纪7 0 年代，生物脱硫代谢机理的研究推动了b d s 的迅速发展。代表为 k o d 锄a 等人于19 6 8 年在研究苯环化合物对农作物生长影响时发现假单孢菌属的 乃p “如聊o n 鲫口，c 口，哟p 玎p s 可以将d b t 氧化成为几种不同的水溶性产物，之后经过 进一步研究提出了生物脱硫的“k o d a m a 途径”，即微生物以d b t 中的碳为代谢目 的，从而可以使硫化物离开油相而进入水相。此外，19 7 4 年，v e bp e t r o c h e m i s c h e s k o m b i n a ts c h w e d t 公司及u n o c a j 公司各自利用不同的微生物进行了生物脱硫的工 业化试验，虽然结果均告失败【2 2 1 ，但是为后续的研究提供了借鉴和经验。 2 0 世纪8 0 年代，专一性脱硫菌种的发现及生物技术的飞跃发展给生物脱硫 的研究带来了新的生机并将其推向了高潮。人们把生物脱硫的研究重点放在以石 油中含量多的含硫杂环有机化合物d b t 为模式化合物【2 3 】的微生物降解研究领域， 并阐明了b d s 代谢机理。此外，基因工程应用于生物脱硫研究，使得利用重组技 术克隆高效、专一性的脱硫微生物及通过有效的分离技术纯化高活性脱硫酶得以 实现。1 9 8 8 年，美国天然气研究所的研究人员分离到一株选择性脱除d b t 中硫的 细菌r 厅d 如c c 螂p 砷p d 凰i g t s 8 ，并于1 9 9 0 年申了美国专利【2 4 ，2 5 1 。随后，买 断该专利的休斯顿能源生物公司在次年将此专利菌株( i g t s 8 ) 的相关基因进行了 克隆和测序，这是生物脱硫研究发展史上的一个里程碑。 2 0 世纪9 0 年代初，遗传学家在分离、克隆和表达脱硫基因的基础上，通过对 脱硫微生物质粒的接合和转化，获得突变菌株；经培养生产出工业化应用的生物 催化剂，使b d s 技术研究取得突破性进展。2 0 世纪9 0 年代中期，美国能源生物 系统公司利用r 力d 如c c 嬲p 砂f 办厂d p d ，括i g t s 8 菌株进行研究，开发出了h d s 和 b d s 相结合达到深度脱硫效果的脱硫工艺，于2 0 0 5 年与p e 仃o s t a r 炼油公司联合， 在阿拉斯加州建成了5 0 0 0 桶天的柴油生物脱硫生产示范装置【2 3 1 ，至此，标志着生 物脱硫技术进入工业化应用研究阶段。 目前，国际上对微生物脱有机硫的研究主要集中在以下几个方面：脱硫微生 黑龙江大学硕士学1 立论文 物的应用、脱硫机理和途径、脱硫动力学及工艺条件的研究、各种微生物脱硫基 因的鉴定和分离技术的应用【2 3 】。 1 2 2 脱硫微生物种类 自发现硫菌属氧化铁杆菌( 砌面6 a c 刀，螂尼r 阳饿f 如船s ) 能够氧化黄铁矿以来， 研究人员一直在寻找其他一些用于脱硫的微生物【2 6 】。目前报道的可用于石油生物 脱硫的主要菌种包括：假单胞菌( a p “如聊d 胛a ss p ) ，红球菌( r 向d 面c c 螂s p ) ，棒 杆菌( c o 缈p 6 叩，p 厂i “埘s p ) ，短杆菌( b 陀v f 6 口c f p 厂i “ms p ) ，戈登氏菌( g d 砌门口s p ) ， 诺卡氏菌( d c 船加s p ) 等( 表1 1 ) 。其中，1 9 8 9 年美国天然气研究所分离得到 的尺向d 如c c 琊肋d 如c 厅加淞i g t s 8 是研究最多的菌种2 7 ，2 8 1 。我国研究比较深入的也 较多的为该菌种f 2 9 1 。 表1 1 国际上公认的具有专一性脱硫能力的微生物 8 】 t a b l e1 11 1 1 ei n t e m a t i o n a 】1 yr e c o g n i z e ds t r a i n so f b d s 【8 】 第1 章前言 肋锄c d c “淞砌d 如j i z r 0 船i g t s 8 1 4 3 】 紫红红球菌i g t s 8美国 勋d 幽c c 搬s p s t r a i ne c r d 1 红球菌e c r d 1 融。如凇叼砌唧d 凰n 1 3 6 f 4 5 】 红串红球菌n 1 3 6 冗厅。咖c c 搬叼砌唧d 凰i 一1 9 f 4 6 】 红串红球菌i 1 9 明- y c d 6 口c 伦一z 册却尾fg 1 r i s 10 1 4 7 】 分直杆菌g t i s1o c d ，) 铆e 6 御f 删s p z d 1 【4 8 】 棒杆菌z d 一1 n e 洳伽嬲出屹疗p 砑严9 1 绿脓杆菌 j 确d 如c c 淞p 聊厅印d 凰l s s e 8 1 f 5 0 j 红串红球菌l s s e 8 1 必弦d 6 口c f p 一删s p x 7 8 1 5 1 l 棒状杆菌x 7 b 彳c 加g d 6 口舸s p 【5 2 】 r h o d o s p o r i d i l 口nt o r 诅1 0 i d e sd b p g 6 6 6 2 【5 3 】 d 甜“帕1 ，为r 面舀c 口聊6 砌竹l a c10 1 5 4 】 勋d 如搬s p h 1 【5 5 】 g d 砌撇s p c y k s l 1 5 6 】 d c 鲫牙妇s p c y k s 2 【5 7 】 彳即6 砌百硎s p m c 5 0 1 【5 s 1 美国 美国 美国 美国 中国 中国 中国 中国 意大利 红冬孢酵母菌d b v p g 意大利 6 6 6 2 脱硫弧菌属l a c l 0 红串红球菌j v h l 戈登氏菌c 1 n ( s 1 诺卡氏菌属c y k s 2 土壤杆菌m c 5 0 1 加拿大 加拿大 韩国 韩国 希腊 n p 删b 研铆甜s p 【5 9 】假单孢菌希腊 1 2 3 微生物脱硫的机理 无机硫和沸点较低的含硫有机物很容易脱去，而沸点较高的二苯并噻吩 ( d b t ) 及其衍生物是典型的难脱除的有机硫的代表物，所以被用作模式化合物 来研究微生物脱硫机理【6 0 1 。 厌氧脱硫微生物降解d b t 的产物为联苯和硫化氢，存在硫化氢的二次污染治 理问题，因此研究的较少。好氧脱硫微生物降解d b t 的产物毒性较低，因此成为 人们研究的热点。 好氧脱硫微生物的脱硫途径主要分以下三种： 7 黑龙江大学硕士学位论文 第一种脱硫途径：二苯并噻吩在微生物的作用下，其中一个苯环发生断裂或 发生羟基化，或噻吩环中硫原子被氧化，但是硫原子未被释放，即二苯并噻吩的 碳架被专一氧化，而c s 键依然保副6 1j 。 第二种脱硫途径：微生物以二苯并噻吩为唯一碳源及硫源，硫原子虽然脱除， 但是会导致燃料的热值下降，最终的降解产物为硫酸、二氧化碳和水。 第三种脱硫途径：为k i l b a j l e 在1 9 8 9 年提出的专一性脱硫途径，即微生物专一 性切断二苯并噻吩c s 键，d b t 可全部或大部分转化成2 ，2 二羟基联苯，有机硫 原子以s 0 4 2 。形式脱除。这种途径可保持二苯并噻吩的芳香结构不变而从中脱硫却 又最少量氧化碳骨架，因此热值下降小，在微生物脱有机硫方面具有广阔的应用 前景。因为反应的四个中间产物英文名称均以英文字母s 开头( s u l p h o x i d e s u l p h o n e s u l p h o n a t e s u l p h a t e ) ，故称为“4 s 途径”。 d 日t s u i r o 孵 ( d b r o ：) s o ：一s o j 图1 1 微生物脱硫的“4 s 途径” f i g 1 1t l h e “4 sp a t h w a y ”o f b d s 2 d 皎d ：。 丛飞 r s c脚【a矿 q 哪 晒， 嘞 删怕m 州：呈仆 + b鸪h 第1 章前言 1 2 4 微生物生物脱硫的应用情况 虽然从二十世纪三十年代开始，s t 捌n s k i 就申报并获得了第一份石油生物脱 硫的专利【6 2 1 ，并在随后的几十年间，不断有微生物脱硫方面的专利获得审批。但 脱硫菌株真正在原油实际脱硫过程中得到应用还是在1 9 7 4 年，前东德v e b p e 仃0 c h e m i s c h e sk o m b i n a ts c h w e d t 公司用从土壤中分离到的未定性混合菌，在装有 原油的间歇式4 l 发酵罐中进行培养，五天内脱去原油中5 5 的硫，但也损失了 3 0 的原油【6 3 】。 此后，科研工作者一直致力于脱硫菌株在原油实际脱硫过程中的应用研究。 1 9 7 8 年，加拿大a 1 b e n a 大学微生物系利用三种不同的海洋环境水样处理p m d h o e b a y 原油，油中有机硫化合物被降解1 6 4 1 。1 9 8 2 年，澳大利亚申报了使用鼢c f 刀淞 脱除原油中的硫的专利，提出此过程为c s 键断裂过程1 6 5 】。1 9 8 7 年u n o c a l 公司在 加入表面活性剂使油水相充分接触的条件下，用假单胞菌使杂环硫羟基化，生成 水溶性产物，但其脱硫效率较低，仅为传统h d s 的1 0 i 矧。该过程引起杂环馏份 在水相中的损失，且作用前水相的处理费用较高。1 9 9 5 年3 月e b c 能源生物公司使用 彤跏k d c c 淞叨砌唧d 凰i g t s 8 进行了中试脱硫研究，但也未取得令人满意的结果。 因此，在二十一世纪之前，关于微生物脱除模型化合物d b t 中硫的报道虽然 较多，但是，脱硫菌株在原油实际脱硫过程中的应用还是很少，而且工艺不成熟， 出现了许多菌种、技术、成本等方面亟待解决的问题。 1 9 9 9 年1 月，e b c 与k e l l o g g 、b r o 、l & r o o t 合作的第一套柴油b d s 工业装 置【2 3 1 建于p e 仃o s t a r 炼油公司的d e z 炼油厂，较好的解决了菌种、技术、成本等 方面的问题，并于2 0 0 1 年第三季度投产，使得脱硫微生物的生产应用终于成为现 实。该装置除了每天能加工脱硫7 9 5 m 3 柴油外，还可生产约4 5 4 千吨年的新型芳 烃磺酸盐商品【6 7 1 。这是迄今为止，第一个成功应用微生物进行原油脱硫的经典实例。 但是，这样的成功典例在微生物脱硫领域中屈指可数。到目前为止，生物脱 硫方面的研究大多仍处在基础研究阶段，生物脱硫工业化生产尚处于起步阶段， 还需要加大研究的力度。 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 5 存在的问题及发展趋势 综上所述，生物脱硫由于其固有的优势，在国内外有着广泛的应用前景，尤 其是随着国内进口高硫原油比例的不断上升，以及国内含硫排放标准的国际化进 程，生物脱硫及其相应的辅助脱硫途径必将占据重要地位。虽然生物脱硫技术具 有很好的应用前景和发展潜力，而且近年来，b d s 技术的研究也取得了很大的进 展，但b d s 技术还存在一些明显的问题。 首先，需要筛选高性能的脱硫菌株，为生物脱硫工业化生产奠定坚实的基础。 筛选出的脱硫菌株不仅要具有专一性的脱d b t 硫的能力，而且还应具有脱硫的广 泛性，对于多种类型的硫均具有较好的脱除能力并且不损伤石油的燃烧值。 其次，提高脱硫菌株对高浓度d b t 的脱除效果，消除脱硫产物s 0 4 2 及2 一h b p 对菌体生长及脱硫的影响。这方面可以通过工艺改造和菌种选育来实现，从而推 进生物脱硫工业化生产的进程。 第三，微生物应用于实际脱油体系时，由于实际的油体成分复杂以及油水比 例和多相界面问题，菌体应用于实际的脱硫有待进一步研究。因此，设计能够适 用于工业化应用的生物脱硫反应器，寻找简单的油、水、生物催化剂的分离方法， 提高分离效率，探讨副产品的加工处理方法，以及提高产品的质量等，都是目前 亟待解决的问题。这些问题是生物脱硫工业化生产的瓶颈问题。因此，b d s 技术 还需要更多的相关科技人员投入更多的精力进行研究和开发。 虽然b d s 技术尚处于研究开发阶段，但在菌种筛选及基因改良方面，随着近 年来生物酶化学、遗传学和生物工程等学科的发展已有良好的开端。国内生物技 术在石油化工领域的应用有一定的基础，应该通过联合攻关，有计划、有步骤的 实现产业化1 6 8 1 。 1 3 本研究的目的、意义和内容 1 3 1 本研究的目的和意义 对生物脱硫而言，获取有价值的菌株是先决条件。我国的生物脱硫研究处于 第1 章前言 起步阶段，与国际上的差距很大，很多研究工作是借助国外的微生物来完成的。 依靠国外已被专利保护的微生物进行脱硫研究，不可能投入工业化生产。因此获 得有自主知识产权的脱硫微生物并对其进行深入研究是本课题工作的重点和目 标。 本课题旨在从采自大庆油田的含油土壤样品中分离、筛选能够通过专一的“4 s 途径”选择性地脱除d b t 的高效菌株，鉴定菌株，并为所选菌株建立完善的培养、 繁殖、保藏体系，并通过诱变育种进一步提高其脱硫率。 1 3 2 本研究的主要内容 本研究的主要内容包括以下几个部分： 【1 脱硫菌株的分离和筛选； 2 】专一性脱硫菌株的分离和筛选； 3 建立比色法及高效液相色谱法对脱硫菌的定性定量分析检测条件； 【4 通过形态学、生理生化反应和分子生物学手段对所分离得到专一性脱硫菌 株进行鉴定； 5 】对所筛选出的专一性脱硫菌，采用紫外诱变、化学诱变及复合诱变的方法 进行诱变育种； 【6 】对菌株的脱硫条件进行初步摸索和探讨，主要从培养基的成分配方、初始 p h 值、培养温度、接种量、转速等方面进行试验，确定菌株的最适脱硫条件。 黑龙江大学硕士学位论文 2 1 材料 第2 章材料与方法 2 1 1 土样 试验选取从大庆油田采集的含油土壤为样品。 2 1 2 试验菌株 专一性脱硫菌株h d b s 1 从大庆油田采集的含油土壤样品中自行分离选育。 2 1 3 培养基 2 1 3 1 分离、纯化、保藏用培养基 【1 牛肉膏蛋白胨培养基6 9 1 牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，氯化钠5 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 值7 0 7 2 ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 2 】无机盐分离培养基7 0 1 磷酸二氢钾2 4 4 9 ，磷酸氢二钠1 2 0 3 9 ，氯化铵2 0 9 ，氯化镁0 4 9 ，氯化锰 o 4 m g ，氯化铁0 1 m g ，氯化钙o 7 5m g ，d b t4 0 m g ，甘油1 0 m l ，p h7 0 7 2 ， 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 3 l b 培养基| 6 9 1 酵母粉5 9 ，胰蛋白胨1 0 9 ，氯化钠5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h6 8 ，1 2 1 灭菌 2 0m i n 。 4 富集培养基【7 0 】：每升l b 培养基中加入5 m g 的d b t 。 【5 固体培养基：每1 0 0 m l 液体培养基加入2 9 琼脂。 2 1 3 2 菌株鉴定用培养基 以下培养基的配制及灭菌参照沈萍【6 9 】和蔡妙英【7 1 】的方法。 第2 罩材料与方法 2 1 3 2 1 生理特征测定用培养基 1 生长温度和耐热性试验用培养基：无机盐分离培养基。 2 氧和二氧化碳的需要试验用培养基：无机盐分离培养基。 3 碳源利用试验用培养基 基础培养基：硫酸铵2 o g ，硫酸镁0 2 9 ，磷酸二氢钠o 5 9 ，氯化钙o 1 9 ，磷 酸氢二钾0 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，1 2 1 灭菌2 0 m i n ； 试验时将需要测定碳源( 甘油、葡萄糖、果糖等) 过滤灭菌加入基础培养基 即可。碳源的终浓度除糖醇类为o 5 1 ，其它为o 1 o 2 。 4 氮源利用试验用培养基 基础培养基：硫酸镁o 2 9 ，硫酸铁o 5 m l ，磷酸二氢钠2 1 3 9 ，氯化钙5 o m l ， 磷酸二氢钾1 3 6 9 ，葡萄糖1 0 o g ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，1 1 2 灭菌2 0 3 0 m i n ； 试验时将需要测定的氨态氮( 磷酸氢二铵) 、硝态氮( 硝酸钾) 过滤灭菌加入 基础培养基即可。氮源的终浓度除糖醇类为o 5 1 ，其它为0 1 o 2 。 5 荧光色素( k i n gb ) 试验用培养基：蛋白胨2 o o g ，甘油1 0 0 9 ，磷酸氢二 钾0 1 5 9 ，硫酸镁0 1 5 9 ，琼脂1 5 0 9 ，蒸馏水1 0 0 m l ，p h 7 2 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 6 脓青素试验用培养基：蛋白胨2 0 o ，甘油1 0 o g ，磷酸氢二钾o 4 9 ，硫酸镁 2 0 0 9 ，硫酸亚铁0 0 1 9 ，自来水1 0 0 0 m l ，调p h 至7 0 7 2 ，1 2 1 灭菌1 5 2 0 血l 。 7 丙二酸利用试验用培养基：酵母膏1 o g ，q m 4 ) 2 s 0 42 0 9 ，k 2 h p 0 40 6 9 ， k h 2 p 0 40 4 9 ，n a c l2 0 9 ，丙二酸钠3 o g ，溴百里酚蓝0 0 2 5 9 ，蒸馏水10 0 0 m l ， p h 值7 o 7 4 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 8 西蒙斯( s i n l i l l o n s ) 氏柠檬酸盐培养基：n a c l5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 2 9 ， n h 4 h 2 p 0 41 9 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 01 9 ，柠檬酸钠2 9 ，水洗琼脂1 2 9 ，蒸馏水9 9 0 m l ， 溴百里酚蓝1 水溶液1 0 m l ，1 2 1 灭菌1 5 商n 。 9 耐盐性和需盐性试验用培养基 基础培养基：无机盐分离培养基； 试验时将氯化钠( 2 ，5 ，7 ，1 0 ) 加入基础培养基中，1 2 1 灭菌2 0 l t l i n 。 【1 0 酒石酸盐利用试验用培养基：蛋白胨1 0 9 ，氯化钠5 9 ，蒸馏水5 9 ，溴百里 黑龙江大学硕士学位论文 酚蓝( 0 2 ) 1 2 5 m l ，酒石酸钾1 0 9 ，调p h 7 4 ，1 1 5 灭菌2 0 m i n 。 2 1 3 2 2 生化特征测定用培养基 1 休和利夫森二氏培养基：蛋白胨2 9 ，n a c l5 9 ，k 2 h p 0 4o 2 9 ，葡萄糖1 0 9 ， 蒸馏水10 0 0 m l ，1 溴百里酚蓝水溶液3 m l ，p h 值7 0 7 2 ，1 1 2 灭菌3 0 m i n 。 进行其它糖、醇发酵试验时，葡萄糖相应由1 的其它糖醇替代。 2 甲基红、v - p 测定试验用培养基：蛋白胨5 9 ，葡萄糖5 9 ，n a c l5 9 ，蒸馏水 1 0 0 0 m l ，p h 值7 0 7 2 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 3 淀粉水解试验用培养基：在牛肉膏蛋白胨固体培养基中加0 2 可溶性淀粉， 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 4 维素分解试验用培养基：蛋白胨5 9 ，n a c l5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 值7 o 7 2 ，1 2 1 灭菌2 0 l n i n 。 【5 果胶水解试验用培养基：酵母膏5 9 ，氯化钙o 5 9 ，琼脂8 9 ，聚果胶酸钠1o g ， 氢氧化钠( 1 n ) 9 m l ，溴百里酚蓝0 2 溶液1 2 5 m l ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，1 2 1 灭 菌不超过5 m i n 。 6 脲酶试验用培养基：蛋白胨1 9 ，葡萄糖1 9 ，n a c l5 9 ，磷酸氢二钾2 9 ，酚 红( 0 2 水溶液) 6 m l ，琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，灭菌后调p h 值6 8 6 9 使 培养基呈橘黄色或微带粉红色为宜，1 15 灭菌3 0 m i n 。 7 苯丙氨基酸脱氨酶试验用培养基：酵母膏5g ，磷酸氢二钠1 9 ，n a c l5 9 ， d l 一苯丙氨酸2 9 ，琼脂1 2 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 值7 0 ，1 2 1 灭菌1 0 r n j n a 8 色氨酸脱氨酶试验用培养基：l 色氨酸3 9 ，磷酸氢二钾1 9 ，硝酸二氢钾1 9 ， 氯化钠5 9 ，乙醇( 9 5 ) 1 0 m l ，蒸馏水9 0 0 m l ，加酚红至微橙的黄色( 2 5 3 0 m g ) ， p h 约为6 8 6 9 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 【9 鸟懒精氨酸脱羧酶试验用培养基 基础培养基：蛋白胨5 9 ，牛肉膏5 9 ，d 葡萄