（微生物学专业论文）黑曲霉基因阻断突变菌株的构建及其功能分析.pdf

黑曲霉基因阻断突变菌株的构建 及其功能分析 微生物学硕士研究生赵春田 指导教师彭远义副教授 唐国敏研究员( 中国科学院微生物研究所) 王敖全研究员( 中国科学院微生物研究所) 摘要 黑曲霉( d s p e r g i l l u sn i g e r ) 是生产葡糖淀粉酶、( 半) 纤维素酶、植酸酶等多种酶制剂和 有机酸如柠檬酸等的重要工业微生物。由于它具有胞外蛋白高分泌性能、与高等真核生物类 似的翻译后加工能力、成熟的发酵工艺和安全性等优点，而成为基因工程中新一代微生物表 达分泌系统，是生产价值昂贵医药产品的最有发展前景的基因工程宿主菌之一。但由于黑曲 霉自身蛋白酶活性较高，使外源蛋白遭受降解而导致产量不高，尽管通过生产中的工艺措施 如降低温度，提高p h ，产物与蛋白质产品早期分离以及添加蛋白酶抑制剂等可以减少目的蛋 白质的降解，但仍不能有效地解决外源蛋白质的降解问题。构建蛋白酶缺陷菌株被认为是目 前提高外源基因表达水平最重要的策略之一。 为改进黑曲霉对外源蛋白的表达分泌本文采用同源重组的方法，分别使编码胞外碱性 蛋白酶的p e p d 基因、胞外酸性蛋白酶p e 硝d 基因和内质网蛋白质降解途径相关基因d e r l 阻 断，并初步研究了这三个基因对外源蛋白漆酶表达分泌的影响。 本研究的主要结果如下： 1 运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的p e p d 基因，该基因编码一种类s u b t i l i s i n 的 胞外蛋白酶p e p d 。实验以黑曲霉g i c c 2 7 7 3 基因组d n a 为模板，p c r 扩增p e p d 基因2 3 1 7 b p 的片段，将此基因片段与p b s - t 载体连接，并在此基因中间b s t bi 位点插入潮霉素抗性基因 ( 砷) 表达单元，构建成p e p d 基因阻断重组质粒p b s d h ，用“i 酶切，由此产生了3 7 k b 的p e p d 基因阻断线性片段。采用原生质体p e g c a c l 2 法将酶切阻断质粒p b s d h 得到的含p 印。 基冈和h p h 表达单元的3 7 k b 线性片段转化a s p e r g i l l u sn i g e rg i c c 2 7 7 3 菌株，在含潮霉素的平 板上筛选到8 4 个潮霉素抗性转化子，从这些抗性转化子中经p c r 检测分离到1 个p e p d 基因 阻断突变菌株a p e p d 6 6 。外源漆酶分泌活性分析显示，黑曲霉p e p d 基因的破坏使其外源漆酶 的分泌表达有所提高。 2 以a s p e r g i l l u s n i g e r g i c c 2 7 7 3 基因组d n a 为模板，用p c r 方法扩增p e p a d 基因2 1 5 7 b p 的d n a 序列，将此基囡片段与p b s t 载体连接，在此基因中间a a ui 位点插入潮霉素抗性基 i 西南农业大学硕士学位论文摘璺 因( 助h ) 在丝状真菌中的表达单元构建成以p b s 为载体的p e p a d 基因阻断重组质粒p b s a d h ， 并通过原生质体p e g c a c l 2 法将h p ai 酶切得到的线性同源片段转化到an i g e rg i c c 2 7 7 3 菌 株中通过潮霉素抗性平板筛选到8 9 个潮霉索抗性转化子，采用p c r 方法从抗性转化子中筛 选到1 个p e p d 基因阻断突变菌株a p e p a d l 9 。外源蛋自漆酶分泌活性分析显示p e p a d 基因的 阻断对漆酶的表达分泌没有显著的影响。 3 以a s p e r g i t t u s n i g e r g i c c 2 7 7 3 基因组d n a 为模板，用p c r 方法分别扩增d e n 基因中的 上游8 3 l b p 和下游9 9 8 b p 两段d n a 序列，将此两段序列按同一方向分别插入质粒p m w i 中 潮霉素抗性基因( h p h ) 表达单元的5 和3 端。构建成d e r l 基因阻断重组质粒p m w - d e r l h 。 然后采用原生质体p e g c a c l 2 法，将酶切p m w - d e r l h 得到的d e r l 基因阻断线性片段转化 a n i g e rg i c c 2 7 7 3 菌株，通过潮霉紊选择平板得到4 5 个潮霉素抗性转化子，然后采用p c r 方 法从这些抗性转化子中筛选到1 个由于同源重组产生的d e r l 基因阻断突变菌株d e r i 2 。外源 基因漆酶表达分泌活性分析显示该突变株的外源蛋白酶漆酶分泌活性明显下降。然后以 a s p e r g i l l u sn i g e rg i c c 2 7 7 3 基因组d n a 为摸板，用p c r 方法扩增d e r l 基因8 0 9 b p 片断，构 建成由构巢曲霉甘油醛一3 一磷酸脱氢酶启动子( p p g p d a ) 和色氨酸终止予( t t r p c ) 引导表 达、以a m d s 为选择标记的d e r l 重组表达质粒p v a d s 。采用原生质体p e g c a c l 2 法以p v a d s 转化d e r l 基因阻断突变菌株ad e r l - 2 ，将d e r i 基因重薪整合到其染色体上，获德d e r l 基因恢 复菌株。外源蛋白漆酶分泌活性分析显示漆酶话性又恢复到原出发菌株a s p e r g i l l u sn i g e r g i c c 2 7 7 3 的水平，说明d e r l 基因在黑曲霉蛋白表达分泌过程中具有重要作用。 关键词：黑曲霉p e p d 基因p e p a d 基因d e r l 基因同源重组 l i c o n s t r u c t i o no fg c n e d i s r u p t i o n m u t a n t si n a s p e r g i f l u sn i g e r a n df u n c t i o n a l a n a l y s i s o ft h eg e n e s c a n d i d a t e ： s u p e r v i s o r ： z h a oc h u n t i a n p e n gy u a n - y i ( c o t t e g eo f a n i m a ls c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , s o u t h w e s ta g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y , c h o n g q i n g , 4 0 0 7 1 6 ，c h i n a ) t a n gg u o r a i n ，w a n ga o - q u a n ( i n s t i t u t eo f m i c r o b i o l o g y , c h i n e s ea c a d e m yo f s c i e n c e ，b e i j i n g ，1 0 0 0 8 0 ，c h i n a ) a b s t r a c t a s p e r g i l l u sn i g e ri s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm i c r o o r g a n i s m sw i d e l yu s e di nav a r i e t yo f i n d u s t r i a l p r o c e s s e si n c l u d i n g t h e p r o d u c t i o n o fab r o a d s p e c t r u m o fe x t r a c e l t u l a r e n z y m e s i g l u c o a m y l a s e ，( h e m i - ) c e l l u l a s e ，a n dp h y t a s e 】a n do r g a n i ca c i d ss u c ha sc i t r i ca c i d m o r er e c e n t l y , t h i s f u n g ih a sb e e nd e v e l o p e da sah o s to r g a n i s mf o rt h ep r o d u c t i o no ff o r e i g n ( h e t e r o l o g n u s ) p r o t e i n s ，e s p e c i a l l yf o rt h ep r o d u c t i o no f r e c o m b i n a n tp r o t e i n ss u p p l i e df o rf o o d ，e n v i r o n m e n t a la n d p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e s t h ee x p l o r a t i o no f a s p e r g i l l u sn i g e rw a s c o n s i d e r e dt ob ev e r ya t t r a c t i v e a si th a san u m b e ro f a d v a n t a g e sc o m p a r e dw i t ho t h e re x p r e s s i o ns y s t e m s t h e s ea d v a n t a g e si n c l u d e t h eh i 曲e f f i c i e n tc a p a c i t yo fp r o t e i ns e c r e t i o n ，p o s t - t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n ss u c ha sg l y c o s y l a t i o n a n dd i s u l f i d e b r i d g e f o r m a t i o nc l o s e rt o h i g he u k a r y o t i co r g a n i s m s t h a nb a c t e r i aa n dy e a s t s ， o p t i m i z e df e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y ，g k a s ( g e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f e ) a p p r o v a li np r o d u c t i o n p r o c e s sa n d s oo n a l t h o u g hs e v e r a lp r o t e i n sh a v eb e e ns u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di na s p e r g i l l u sn i g e r , t h es e c r e t e dy i e l d so fm a n y h e t e r o l o g o u sp r o t e i n s ，e s p e c i a l l ym a m m a l i a np r o t e i n s ，r a r e l yr e a c h t h e g r a m p e r d i t r el e v e l o n eo f t h em a j o ro b s t a c l e si na c h i e v i n gh i g hl e v e lp r o t e i ne x p r e s s i o na n d s e c r e t i o ni st h ep r o t e o l y t i cd e g r a d e t i o no ft h ee x p r e s s e dh e t e r o l o g o u sp r o t e i nb yh o s tp r o t e a s e s ，a s h e t e r o l o g o u sp r o t e i n sa r eo f t e nm o r op r o n e t op r o t e o l y s i st h a nh o m o l o g o u sp r o t e i n s b i o p r o c e s s i n g s t e p s s u c ha sd o w n s t r e a mp r o c e s s i n ga tl o wt e m p e r a t u r e s ，t h ei m p r o v e m e n to fp h ，t h ee a r l y s e p a r a t i o no fp r o d u c ta n dp r o t e a s e ( s ) o ft h eu s eo fp r o t e a s ei n h i b i t o r sm i g h tr e d u c ep r o t e o l y s i s h o w e v e r ，t h e yw i l lc e r t a i n l yn o te l i m i n a t et h ep r o b l e mb e c a u s em u c h o ft h ed e g r a d a t i o no c c u r si n v i v od u r i n gt h ep r o d u c t i o no ft h ep r o t e i n d i s r u p t i o no rd e l e t i o no ft h ep r o t e a s e so ft h eh o s ti s s u p p o s e d t ob ea v e r yp o w e r f u la p p r o a c h t or e d u c e p r o t e o l y t i cd e g r a d a t i o no f t h ee x p r e s s e dp r o d u c t s a n dt oi m p r o v e p r o t e i np r o d u c t i o n i nt h i st h e s i s ，t w oa n i g e rp u t a t i v es e c r e t e dp r o t e a s eg e n e s ，t h ep e p da n dt h e p e p a d g e n e s ，a n d o n e a n i g g e n ei n v o l v e di nt h es e c r e t o r yp r o t e i nd e g r a d a t i o np r o c e s si ne n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r ) ，t h ed e r lg e n e ，w e r ed i s r u p t e du s i n gh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nt e c h n o l o g y i no r d e rt o i m a s t rd i s s e r t a t i o no f s o u t h w e s ta g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t ya b s t r a c t i m p r o v eh e t e r o l o g o u sp r o t e i ne x p r e s s i o na n ds e c r e t i o ni na s p e r g i l l u sn i g e r i nt h er e s u l t a n ts t r a i n s ， a p e p d ，a p e p a da n da d e r l ，a c t i v i t i e s o ft h et a r g e t h e t e r o l o g o u sp r o t e i n l a c c a s ew e r et e s t e d r e s p e c t i v e l yt os t u d yt h ei n f l u e n c eo fd i s r u p t i o no f t h e s eg e n e so nt h ed e g r a d a t i o no f h e t e r o l o g o u s p r o t e i ni na n i g e r m a i nr e s u l t so f t h i sr e s e a r c ha r es h o w na sf o l h ) w s ： 】t h e p e p dg e n ef r a g m e n tw a sa m p l i f i e db yp c rw i t h a s p e r g i l l u sn i g e rg i c c 2 7 7 3g a n o m i c d n a a st e m p l a t ea n dc l o n e di n t ov e c t o rp b s t h es e l e c t i o nm a r k e r , a h y g r o m y c i nr e s i s t a n c e ( h p h ) e x p r e s s i o nc a s s e t t e ，w a si n s e r t e di n t ot h ep e p dg e n er e s u l t e di nt h ed i s r u p t e dp l a s m i dp b s d h t h e p l a s m i dw a sc o m p l e t e l yd i g e s t e d w i t hs t uit o g e n e r a t ea3 7 k b l i n e a rf r a g m e n t , i nw h i c ht h e h y g r o m y c i nr e s i s t a n c ee x p r e s s i o nc a s s e t t ew a sf i a l d c e dw i t ha1 0 6 7 b p5 f r a g m e n ta n da11 8 0 b p3 f r a g m e n to ft h ep e p dg e n e i tw a st h e nu s e dt c i t r a n s f o r mg i c c 2 7 7 3s t r a i n b yp e g m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n t h er e c i p i e n tg i c c 2 7 7 3c o n t a i n sa ni n t e g r a t e dl a c c a s ee x p r e s s i o nc a s s e t t e t o t a l8 4 t r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e db y h y g r o m y c i n r e s i s t a n c es e l e c t i o n ，a n dw e r es c r e e n e db yp c r u s i n ga p r i m e ra n n e a l i n g t ot h e h p hg e n ea n d a p r i m e ra n n e a l i n g t ot h es e q u e n c e so u t s i d et h e3 h o m o l o g o u s f r a g m e n t t r a n s f o r m a n t p e p d 6 6w a si d e n t i f i e dt ob ea p e p dg e n ed i s r u p t i o ns t r a i n t h ee f f e c to f p e p dd i s r u p t i o ni n a p e p d 6 6o nl a c c a s ee x p r e s s i o nw a sa n a l y s e d t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e d i s r u p t i o no f p e p dg e n ei m p r o v e dh e t e r o l o g o u sp r o t e i nl a c c a s ep r o d u c t i o nb y6 - 7 w i t h o u ta n y n e g a t i v e e f f e c to nt h et o t a l p r o t e i np r o d u c t i o n d i s r u p t i o no ft h ep e p dg e n ed i dn o th a v ea n y n e g m i v ee f f e c to ng r o w t h t h u sd i s r u p t i o no f t h ep e p dg e n ei na r e c i p i e n ts t r a i nw o u l db eh e l p f u l f o rp r o t e c t i n gt h e h e t e r o l o g o u sp r o t e i n sf r o md e g r a d a t i o n 2 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp b s a d hf o rt h e p e p a dg e n ed i s r u p t i o ni na s p e r g i l l u sn i g e rw a s c o n s t r u c t e d t h ep l a s m i dc o n t a i n e d t h e p e p a d g e n eu p s t r e a m ( 即1 2 1 3 b pa n dd o w n s t r e m n ( t ) 9 4 3 b p h o m o l o g o u sf r a g m e n t sw i t hi n s e r t i o no f t h ee x p r e s s i o nu n i to f t h eh y g r o m y e i nr e s i s t a n c eg e n e ( h p h ) b e t w e e nt h e m t h epa n dtd n a f r a g m e n t sw e r es y n t h e s i z e db yp c rf r o ma s p e r g i l l u sn i g e r g e n o m i cd n a t h ep l a s m i dw a sc o m p l e t e l yd i g e s t e dw i t ht h en p a1 t h er e s u l t a n t3 7 k bl i n e a r f r a g m e n tw a si n t r o d u c e di n t ot h ea s p e r g i l l u sn i g e rg i c c 2 7 7 3c o n t a i n i n gl a c c a s ee x p r e s s i o nc a s s e t t e b yp e g - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n 8 9h y g r o m y c i nr e s i s t a n c et r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e d ，a n do n e s t r a i nn a m e da p e p a d l 9 w a si d e n t i f i e dt ob et h e p e p a dg e n ed i s r u p t a n tb yp c ra n a l y s i sd a t ao f f u n c t i o n a la s s a y o f t h e p e p a d l 9 s t r a i n i n d i c a t e d t h a t h e t e r o l o g o u s p r o t e i n l a c c a s e p r o d u c t i o n w a s h a r d l yi m p r o v e d ， 3 t h ed e r l g e n ed i s r u p t i o np l a s m i dp m w d e r l hw a sc o n s t r u c t e d ，i nw h i c ht h es e l e c t i o n m a r k e rh y g r o m y c i nr e s i s t a n c e ( h p h ) e x p r e s s i o nc a s s e t t ew a sf l a n k e dw i t h 8 3 1 b p5 h o m o l o g o u s f r a g m e n ta n d9 9 8 b p3 h o m o l o g o u sf r a g m e n t t h ed i s r u p t i o np l a s m i dw a sc o m p l e t e l yd i g e s t e dw i t h n p a 1a n dn r uia n dt h er e s u l t a n tm i x t u r eo fl i n e a rf r a g m e n t sw a st h e nu s e d t ot r a n s f o r mg i c c 2 7 7 3 i v s t r a i nw h i c hc o n t a i n si n t e g r a t e d a c c a s ee x p r e s s i o np l a s n f i d t o t a l4 5t r a n s f o r m a n t sw e f eo b t a i n e d a n ds c r e e n e db yp c r o n es t r a i nn a m e d d e r l 2w a si d e n t i f i e dt ob et h ed e r lg e n ed i s r u p t a n t t h e e f f e c to l d e r lg e n ed i s r u p t i o no n a e c a s ee x p r e s s i o nw a sa n a l y s e d h o w e v e r , t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a t t h ed i s r u p t i o no f d e r lg e n ed i dn o ti m p r o v eh e t e r o l o g o u sp r o t e i nl a c c a s ep r o d u c t i o nb u td e c r e a s e di t d r a m a t i c l y i no r d e rt os t u d yt h ef u n c t i o no f d e r lg e n em r t h e lar e c o m b i n a n tp l a s m i dp v d a s f o r d e r le x p r e s s i o nw a sc o n s u c t e db yf u s i n gt h ed e r lg e n eb e t w e e nt h eg l y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t e d e h y d r e g e n a s ep r o m o t e r ( e g t 矗a ) a n dt h et r e c g e n et e r m i n a t o r ( t t r p c ) f r o m t h ea s p e r g i l l u s n i d u l a n si nt h ep l a s m i n dp v h b m t h ea m d sg e n ef r o mt h ea n i d u l a n sw a sa l s oi n s e r t e di n t ot h e p l a s m i d a th i n di i is i t e t h i sv e c t o rw a sc o t r a n s f o r m a t e di n t oa n i g e r d e r l - 2u s i n gt h ea m d sg e n e a sad o m i n a n tm a r k e rf o rs e l e c t i n gt r a n s f o r m a n t so nt h eb a s i so fa c e t a m i d eu t i l i z a t i o n r e s u l to f l a c c a s ea c t i v i t ya s s a yi n d i c a t e dt h a tt h el a c c a s ee x p r e s s i o na n ds e c r e t i o np a r t l yg e tb a c kt ot h el e v e l o ft h a to ft h ew i l d - t y p es t r a i na s p e r g i l l u sn i g e ，g i c c 2 7 7 3 i ts h o w e dt h a td e r lg e n ep l a y e da n i m p o r t a n tr o l ei np r o t e i ne x p r e s s i o na n d s e c r e t i o ni na s p e r g i l l u sn i g e r k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r ，p e p dg e n e ，p e p a dg e n e ，d e r lg e n e ，h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n v 资助项目 本研究由中国科学院微生物研究所与美国g e n e n c o ri n t e r n a t i o n a li n c 国际 合作项目“黑曲霉非必需基因的缺失和高通量基因破坏法分析黑曲霉基因功能” 资助。 s u p p o r t e db y t h e j o i n tp r o j e c tg r a n t e db y g a n e n c o ri n t e r n a t i o n a li n c o f u s a “p r o p o s n f o rd e l e t i o no f a s p e r g i l l u sn i g e r n o n e s s e n f i m g e n e s t o i m p r o v e h e t e r o l o g o u sp r o t e i np r o d u c t i o n a n df o r d e v e l e p m e n t o fh i 曲t h r o u g h p u t g e n e d i s r u p t i o nm e t h o d s t oa n a l y z ef u n c t i o n so f a s p e r g i l l u s g e n e s ” 两南农业大学硕j 一学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 丝状真菌在工业、农业、医药以及基础生物学研究中具有重要作用。例如，重要的抗生 素产生菌产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m ) 和顶头孢霉( c e p h a l o s p o r i u ma e r e m o n i u m ) 分别能产生青霉素和头孢菌素，用于疾病的治疗，但有些丝状真菌又能产生对人体有害的物 质，如黄曲霉产生黄曲霉毒素：一些工业丝状真菌如黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 和米曲霉( 一 o r y z a e ) 被广泛用于生产酶类( 如淀粉酶和蛋白酶) 和有机酸( 如柠檬酸等) ；丝状真菌又是 重要的农作物的致病菌，并能导致粮食等贮藏过程中的腐败变质。同时又有一些丝状真菌( 如 白僵菌、绿僵菌、哈氏木霉等) 可用于农作物病虫害的生物防治；丝状真菌中的构巢曲霉( 一 n i d u l a m ) 和租糙脉孢霉( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 由于其相对简单而被作为“模式”种用于真核 生物的一些基础生物学特性研究。近年来，对瑞氏木霉( t r i e h o d e r m a r e e s e i ) 的遗传转化研究 也有了长足的进展( i z 天虹等，2 0 0 0 ) 。由于丝状真菌在经济上和科学中的熏要性，多年来一 直被广泛地研究，以便更好地了解和利用其有益特性和控制其不利性状。 1 1 丝状真菌外源基因表达分泌系统的特点 早在一个世纪之前，人们已经知道真菌可以外泌大量的酶和有机酸，这带来了酶和有机 酸工业的发展。当今发酵工业利用丝状真菌生产大量产品，年产值己达几十亿美元。在大规 模应用的同时，罪随酵母分子生物学的发展人们也开始对丝状真菌进行分子生物学的研究， 以期进一步开拓丝状真菌在工、农、医、食品中的应用和控制严重危害人类健康和农作物的 致病真菌。1 9 7 9 年，c a s e 等首先在粗糙脉孢菌( n e - o s p o r ae r a s $ o ) 建立了d n a 转化系统( c a s e e a , ，1 9 7 9 ) ，4 年后，构巢曲霉( a s p e r g i l l u s n i d u l a n s ) d n a 转化成功( b a l l a n e e e t a ，1 9 8 3 ) ， 随即便开始了以黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、瑞氏木霉用作基因工程宿主菌的研究，其中碱 性脂肪酶、牛凝乳酶等工程菌已投入应用。 工业丝状真菌不但是重要的工业生产菌株，而且作为外源基因的表达系统具有优越于大 肠杆菌( e s c h e r i c h i ac e l l ) 和酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 系统的独特优点。大肠杆 菌在高表达外源基因时容易产生包涵体，且缺少一些真核细胞的翻译后修饰机制，酿酒酵母 分泌蛋白的能力较弱，且往往产生过度糖基化，因此表达高等真核生物基因时，产生有活性 的蛋白质比较困难。丝状真菌则具有很强的外分泌蛋白的能力，并能对合成的真核蛋白较正 确地进行各种翻译后加工，包括肽链的剪切和糖基化等，加之其糖基化形式较酵母更类似于 高等真核生物。此外，许多菌种如黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 、米曲霉( a s p e r g i l l u s o r y z a e ) 已 在食品如中长期应用，被确认是安全的。同时，丝状真菌的发酵工艺及下游加工技术已很 成熟，这些都有利于丝状真菌基因工程菌投入工业应用 丝状真菌具备极强的外泌蛋白的能力。已有报道，曲霉、术霉在发酵过程中能分泌高达 4 0 克，升的内源蛋白( 如葡糖淀粉酶、纤维素酶) ( c a l m e l se t 口f 1 9 9 1 ：b o r k o v i c hk a e la l 。 西南农业大学硕十学位论文第一章文献综述 1 9 8 9 ) 。尽管丝状真菌分泌内源蛋白的能力是振奋人心的，但是已有的实践表明外源蛋白的产 齄远不如内源蛋白高，通常外源蛋白的产量在每立升几十微克至1 5 0 毫克之间。当然也有少 数例外，如在构巢曲霉中构建的牛凝乳酶原基因工程菌，其牛乳酶原的分泌量超过1 克升 ( d u r m c o l e m a nn se t a l ，1 9 9 1 ) ，这是迄今为止投产的第一个食品酶的基因工程丝状真菌。目 前，为利用丝状真菌作为宿主菌的优点，人们在加强基础研究的同时根据基础研究所获得的 知识采取应对策略，力图使其成为生产高附加值的重组药用蛋白的理想宿主菌。 1 2 丝状真菌遗传转化系统研究进展 基因工程首先在原核生物一细菌中获得成功，这大大地激励了许多科学家将这一技术应 用到丝状真菌的研究中，目前丝状真菌的遗传转化在理论上和应用上均取得了较大的进展。丝 状真菌作为基因工程的受体菌有着与细菌、酵母不同的独特优点：丝状真菌具有很高的蛋白 质分泌能力；能够正确进行各种翻译后加工，并且与高等真核生物类似；丝状真菌如曲霉等 又是公认的安全生产菌株，发酵工艺及下游加工技术成熟。因此在丝状真菌中建立一个有效 的转化系统有着相当重要的经济价值。 1 2 1 转化丝状真菌种类 第一个被转化的丝状真菌是由m i s h r a 和t a t u m 于1 9 7 3 年报导的粗糙链孢霉，他们用来自 野生型菌株的总d n a 处理肌酵缺陷型菌株获得了肌醇原养型转化菌落，但当时尚没有可利用 的分子技术对转化子进行鉴定c a s e 等于1 9 7 9 年首次证实了d n a 介导的租糙链孢霉的遗传 转化，他们证实在转化子中含有整合于染色体上的质粒d n a 片段，随后，在越来越多的丝状 真菌中实现了遗传转化，尤其在近l o 年问，丝状真菌遗传转化系统研究进展迅速。据不完全统 计，到目前为止已经在1 0 0 多种丝状真菌中成功地进行了转化试验，其中有许多种类可被具 有不同选择标记的多种载体所转化。已转化成功的丝状真菌中有工业真菌( 如黑曲霉、米曲 霉等) 、医用真菌( 如产黄青霉、顶头孢霉) 、植物病原真菌( 如玉米黑粉菌、小麦全蚀菌等) 、 杀虫真菌( 如白低菌、绿僵菌) 、真菌上寄生真菌( 如哈氏木霉) 、食用真菌( 如裂褶菌、鬼 伞等) 、菌根真菌( 如卷边桩菇、漆蜡蘑) 等。 1 2 2 丝状真菌的转化方法 转化已成为丝状真菌分子生物学技术中的基本技术，它与原核生物相比较由于真菌细 胞壁的复杂性和至今尚没有适台应用的自主复制质粒等原因外源基因进入丝状真菌，并通 过重组整合染色体的频率不高。目前，提高丝状真菌的转化效率和同源重组频率是丝状真菌 基因： 程研究中有待解决的问题。 1 2 2 ，1 原生质体p e g 转化方法 1 9 7 8 年，h i n n e n 等首先利用聚乙二醇( p e g ) 作介质转化酵母原生质体获得成功。此后 原生质体p e g 转化方法逐渐被引用于粗糙脉孢霉、构巢曲霉等各种丝状真菌。p e g 是d n a 与原生质体的融合剂。转化过程中，p e g 与水分子之间以氢键结合，使原生质体脱水，在钙 离子帮助下，p e g 形成d n a 和原生质体之间的分子桥，引导d n a 进入脱水后的原生质体， 2 西南农业大学硕士学位论文第一章文献综述 形成转化子。原生质体p e g 转化方法操作简便，但有些缺点，例如转化频率不十分稳定；由 于p e g 介导的凝聚作用，细胞易聚合并产生二倍体甚至多倍体，以及再生菌落包埋在上层培 养基中不易挑取等。但该转化方法目前是丝状真菌转化中最普遍使用的方法。 1 2 2 2 脂质体转化法 即先用脂质体把d n a 包裹在内，然后将脂质体与原生质体诱导融台。这种方法虽然额外 增加了制备脂质体的过程，但它的转化效率却比c a c l 2 法高得多( r a d f o r de l 以，1 9 8 1 ) 。 1 2 2 3 电激转化法 基本原理是在高电压脉冲作用下，使原生质体或菌体细胞在质膜上形成瞬间通道 ( m 2 0 一l o o n m ) ，从而促使外源d n a 的摄入。由于质膜的可修复性，外加电场造成的膜穿孔在一 定时间内可自动修复。电穿孔方法已成功应用于哈氏木霉、粗糙脉孢霉等丝状真菌。但在多 数实例中，其转化效率仍低于原生质体- p e g 法，因而并未普遍应用。 1 2 2 4 醋酸锂转化法 这种方法转化的对象是完整的细胞，对于丝状真菌，一般要用萌发的分生孢子进行l i a c 处理。其转化效率高于原生质体法，但此法似乎只限于c r a s s a 和少数几种丝状真菌，在曲 霉等其它丝状真菌中转化效率非常低。 1 2 2 5 农杆菌介导的转化法 农杆菌感染植物时，能将其t