（动物学专业论文）镉与硒对小白鼠免疫毒性作用的研究.pdf

y 7 3 1 1 ；7 0 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的 成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内 容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对 本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：诬垂盆。日期：望避盥 笾 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权 归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规 定，同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保 存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直 接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：j 瘁圭区导师签名：! 丛丝垫日期：趋鳖垒丝蚴 致谢 时间的脚步匆匆走过了1 0 0 0 多个同夜。转眼间毕业的f 1 子到了，在这里我 首先向我的导师张迎梅教授表示衷，5 、的感谢。张老师严谨的治学态度，广博的学 术知识，开阔的研究思路，平易近入和身体力行的生活作风，宽厚的长者风度都 让我受益终生。感谢张老师对我论文工作的指导并为论文工作提供了最佳的实验 条件，使我在生物学实验技术方面得到了很大的提高，论文工作得以顺利完成。 感谢刘乃发教授、王子仁教授、胡建成副教授、盂雪琴和张立勋老师在我实 验期间给予的无私帮助，多次为我完成实验提供便利条件。感谢生物制品所动物 房和免疫室的各位老师为我提供实验动物和部分药品。感谢中心实验室各位老师 的大力支持。 感谢本实验室研究生龙静、王丙莲、黄德军、刘阳、刘江海、宋刚、罗松年 以及2 0 0 0 级本科毕业生李丰同学在实验方面给予我的无私帮助。 最后，感谢我的父母以及其他所有亲人、朋友和同学们，谢谢他们对我的大 力支持，帮助和无私奉献。 2 0 0 5 年5 月 风 兰州大学硕士研究生学位论文萝 中英文名词索弓 一醋酸萘酯酶a n a e ，a c i d - n a p h t h y l a c e t a t ee s t e r a s e 植物血凝素 金属硫蛋白 p h a t p h y t o h e m a g g l u t i n i n m t ，m e t a l l o t h i o n e i n 淋巴细胞转化实验【。t t ，l y m p h o c y t e t r a n s f o r m a t i o n t e s t 四甲基偶氮唑蓝 台盼蓝染色素 镉 硒 半数血清溶血素 绵羊红细胞 半数致死量 半数致死浓度 半数有效量 刺激指数 m t t ，t h i a z o l y b l u e t b ，t r y p a n b l u e 。c d ，c a d m i u m s e ，s e l e n i u m h c s o h e m o l y s i n s r b c ，s h e e p r e db l o o dc e l l l d 5 0 ，m e d i a n l e t h a ld o s e l c s o ，m e d i a n l e t h a lc o n c e n t r a t i o n e d 5 0 ，m e d i a ne f f e c t i v ed o s e s i ，s t i m u l a t i n gi n d e x 兰州大学硕士研究生学位论文 中文摘要 随着工农业发展，环境中有毒或潜在有毒化学物质种类和数量与日俱增，对 人类生活与生存构成威胁。重金属作为一种主要环境污染物在大气、土壤、水体 和生物体之间不断迁移和转化，进入机体后不易排泄，容易蓄积，当超过机体生 理负荷时可以引起生理、生化功能的改变，导致急慢性疾病或产生远期危害。本 文通过对小鼠( m i c e ) 腹腔注射方式研究了二种环境中常见的重金属镉( c a d m i u m ， c d ) 和硒( s e l e n i u m ，s e ) 对小鼠产生的急性毒性和免疫毒性作用，以此来探讨它 们的毒性机制。 急性毒性实验得出氯化镉和亚硒酸钠的半数致死剂量分别为8 4 o o m g k g 和 2 7 7 5 m g k g ，个体大的小鼠对相同浓度的重金属耐受性明显高于个体较小者。雌 性小鼠的耐受性也高于雄性。 慢性染毒结果表明，镉对小鼠免疫功能的影响更明显，在整个实验期间，主 要表现为免疫抑制作用。染硒组小鼠免疫系统各指标变化相对复杂，随着时间的 延长，在低硒剂量组2 8 4 2 天这段时间内，出现一个a n a e 阳性率表达高峰，而 高硒组a n a e 阳性率数值与染毒时间长短呈明显的负相关，染毒时间越长，阳性 率越低。不同剂量和不同金属染毒组对淋巴细胞转化率的影响也不相同，低硒组 对淋巴细胞转化率的影响不明显，与对照组相比无显著差异。而高硒组转化率变 化较明显，第3 2 8 天内s i 持续降低，第3 5 4 2 天出现一个短暂高峰。备染硒 剂量组脾脏指数均随染毒时间延长而降低，第5 6 天降到最低点。胸腺指数的变 化与脾脏指数的变化升i 尽相同，低硒组胸腺指数除在染毒第1 4 、3 5 、4 2 天有降 低外其余时间与f 常对照组相比均无明显差异，高硒组随染毒时间延长胸腺指 数与对照组相比有较大降幅变化，在染毒第5 6 天数值降到最低，且明显低于低 硒组。低硒组在染毒3 5 4 2 天1 1 c 5 0 水平出现一个短暂的高峰期，甚至高出对照 组水平，远高于高硒组水平，之后随染毒时问的延长不同剂量硒染毒组h c 5 0 水平 均持续降低。各染毒组均呈现明显的时问一效应关系和剂量一效应关系。 兰州大学硕士研究生学位论文 联合染毒组实验结果显示，硒对镉免疫毒性有明显拮抗作用。硒加镉染毒组 与镉染毒组相比各项免疫指标均有不同程度的上升。 对染毒小鼠外周血涂片观察显示，染毒组白细胞异常率均高于对照组，次序 为硒加高镉组 高镉组 硒加低镉 高硒组 低镉组 低硒组。 综上所述，镉和硒对小鼠具有免疫毒性，镉毒性大于硒毒性，硒对镉的免疫 毒性有不同程度的拮抗作用。镉和硒通过损伤细胞免疫和体液免疫功能，降低机 体抵抗能力，影响机体健康。 关键词：镉；硒；小鼠；免疫毒性；毒理机制 兰州大学硕士研究生学位论文 翩 a b s t r a c t w i t ht h e d e v e l o p m e n t o f i n d u s t r y a n d a g r i c u l t u r e ，m o r e a n dm o r e c h e m i c a ls u b s t a n c e se n t e r e di n t oe n v i r o n m e n t ，w h i c hh a ss e r i o u s l ya f f e c t e d t h eh u m a nh e a l t h a n dh e a v ym e t a l sw e r em a i np o l l u t a n t st h a tc o u l d n tb e e x c r e t e d e a s i l y f r o mt h eb o d y 1 w h e nt h e ya c c u m u l a t e dt o om u c ht ob e a c c e p t e db yo r g a n i s m s ，t h e yw o u l dc a u s ea c u t eo rc h r o n i cd i s e a s e i nt h i s p a p e 5 t h et o x i c i t yo fc a d m i u m ( c d ) a n ds e l e n i u m ( s e ) a n dt h e i r t o x i c i t y m e c h a n i s m so n i m m u n o l o g i c a l f u n c t i o nw e r es t u d i e d u s i n g m i c ea st e s t a n i m a l t h ea c u t et o x i c i t ye x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tl d s oo fc da n ds ew e r e 8 4 0 0 m g k g a n d2 7 7 5m g k g r e s p e c t i v e l y a n dt h es u p p o r t a b i l i t yo fb i g g e r m i c ew a sb e t t e rt h a ns m a l l e r ，t h ef e m a l ew a sb e t t e rt h a nt h em a l e t h ec h r o n i ct o x i c i t y e x p e r i m e n t s i n d i c a t e dt h a tt h ee f f e c t so fc do n i m m u n o l o g i c a l f u n c t i o nw e r em o r eo b v i o u st h a n s e ，a n d i t a p p e a r e d i m m u n o l o g i c a lr e s t r a i nd u r i n gt h ew h o l ee x p e r i m e n t t h ee f f e c to fs ew a s m o r e c o m p l e x w i t ha p e a k o na n a ep o s i t i v e p e m e n t a g eb e t w e e n t h e e x p o s u r et i m eo f2 8a n d5 6da n a ep o s i t i v ep e r c e n t a g eo fh i g h e rs ed o s e w a s n e g a t i v e l y c o r r e l a t i v et o e x p o s u r et i m e l y m p h o c ”et r a n s f o r m a t i o n p e r c e n t a g ew a s d i f f e r e n ti nt h ed i f f e r e n td o s e g r o u p ，t h ei n f l u e n c eo fl o w e rs e d o s ew a sn o t o b v i o u s s t i m u l a t i n gi n d e x ( s i ) o fh i g h e r c dd o s e g r o u p d e c r e a s e dc o n t i n u o u s l yi n3 2 8d a n da p p e a r e dap e a ki n3 5 4 2d s p l e e n i n d e x e si ns eg r o u p sd e c r e a s e dc o n t i n u o u s l yd u r i n gt h ew h o l ee x p e r i m e n t t h ec h a n g e so ft h y m u si n d e xw e r ed i f f e r e n tf r o ms p l e e ni n d e x t h y m u si n d e x d e c r e a s e do b v i o u s l yo n14 ，3 5 。4 2di nl o w e rs eg r o u pa sc o m p a r e dw i t h 4 兰州大学硕士研究生学位论文蟛 ，n c o n t m l ，a n dt h e r ew e r ed e g r e s s i v ec h a n g e si nh i g h e rs eg r o u p a p p e a r i n gt h e l o w e s tl e v e lo n5 6d h e m o l y s i n ( h c s o ) i nl o w e rs eg r o u pa p p e a r e dap e a ki n 3 5 4 2d ，f a rs t r o n g e rt h a nh i g h e rs e g r o u p a n di tk e p to nd e c r e a s i n gi na l ls e g r o u p s i nt h er e s tt i m et h e r ew a so b v i o u st i m e - e f f e c ta n dd o s e - - e f f e c t r e l a t i o n si na l le x p o s u r eg r o u p s t h et o x i c i t ye x p e r i m e n t so fc da n ds em i x t u r ei n d i c a t e dt h a ts ec o u l d l e s s e nt h e i m m u n o t o x i c i t y o fc d a n da l l p a r a m e t e r s s h o w nt h a tt h e i m m u n o t o x i c i t ye f f e c t sw e r em u c hg r i e v o u si nm i x t u r ei o n st r e a t m e n tg r o u p s t h a nt h a ti ns i n g l ec dt r e a t m e n t g r o u p s t h ep e r c e n t a g eo fp e r i p h e r a lw h i t eb l o o dc e l l si n a l lt r e a t m e n tg r o u p s w e r eh i g h e rt h a nc o n t r o l ，a n dt h ep e r c e n t a g ew a s h i g h e s ti ns e a n d h i g h e rc d g r o u pc o m p a r e d w i t ha l lg r o u p s i no n e w o r d ，s ea n dc dh a di m m u n o t o x i c i t yi nm i c e 。t h e t o x i c i t yo fc d w a s s t r o n g e rt h a ns ew h i c hh a da n t i - f u n c t i o na b i l i t yt ot h ei m m u n o t o x i c i t yo fc d h e a v y m e t a li o n sc o u l dr e s t r a i nt h e i m m u n o a b i l i t yt h r o u g hd a m a g i n gh u m o r a l r e s p o n s e a n dc e l l - m e d i c a t e dr e s p o n s e ，r e d u c e d i m m u n o a b i l i t y k e y w o r d s ：c a d m i u m ；s e l e n i u m ；m i c e ；i m m u n o t o x i c i t y ；t o x i c o l o g i cm e c h a n i s m 兰州大学硕士研究生学位论文 目u 百 随着现代工农业的迅猛发展，环境污染日趋严重，引起世界各国的共同关注。 环境毒理学是利用毒理学方法研究环境污染物对人体健康的影响及其机理的学 科，是环境医学的一个组成部分，也是毒理学的一个分支。它主要通过动物实验 来研究环境中化学物质对机体的毒性反应、严重程度、发生频率和毒性作用机制 的科学，也是对毒性作用进行定性和定量评价的科学。环境污染物对机体的作用 一般具有下列特点：接触剂量较小：长时问内反复接触甚至终生接触；多种环境 污染物同时作用于机体：接触的人群既有青少年和成年人，又有老幼病弱，易感 性差异极大等。近几十年来，由于工业的发展，种类繁多的化合物及其化工产品 广泛的进入各个工农业生产部门和人类生活领域，为人类的物质生活和精神文明 建设提供了很大帮助。但是人们也逐渐认识到，这些化合物的存在对居民的生活 和健康造成一些不良影响，这方面的研究也逐渐受到人们的重视。 生物圈是各种生物栖息的环境，除了生物体固有的成分外，其周围环境的所 有成分基本上都是无机的。生物经常与各种有机或无机物接触，并利用他们或受 其影响。存在于生物体内的元素大致分为四类：第一类为必须元素：第二类为可 能有益或辅助营养元素；第三类为沾染毒素，第四类为有毒毒索。但无论哪一种， 只要过量就会发生中毒。在生物圈的元素分布中，大约7 5 是金属元素，通常引 起动物( 包括人) 中毒的主要是一些重金属元素。近年重金属污染导致的各种问 题已经有不少报道和记载，5 0 年代日本水俣病( 汞中毒) ，骨痛病( 镉中毒) ， 以及我国常见的“碱病”( 硒中毒) 引起了世人对重金属污染的关注，重金属及 其化合物的研究日益受到人们重视，关于重金属污染的相关研究报道也越来越 多。重金属污染不仅危害个体而且影响遗传，除了导致体内各个脏器的损害，还 影响生殖腺，导致后代骨髂发育畸形，智力障碍。 6 国 兰州大学硕士研究生学位论文艇 1 镉的性质 l _ l 物理化学性质镉是一种淡蓝色而具有银白色光泽的金属，熔点3 2 1 ，沸点 7 6 7 。c ，质软耐磨抗腐蚀。镉在潮湿的空气中会缓慢氧化，加热易挥发，镉不溶 于碱，易溶于酸。金属镉本身无毒，但其蒸汽有毒，化合物毒性较强。在自然环 境下，镉主要以+ 2 价形态存在。 1 2 镉在动物体内的吸收镉是一种危害较大的重金属毒物，造成镉污染的主要 原因有冶炼厂污染、工业三废排放、镀镉器皿的使用和一些含镉农药、医药使用 不恰当或过量。镉主要通过呼吸和饮食进入人体，溶解性的镉化合物也可通过皮 肤渗入。镉在肺和肠中吸收，通过血液转运至身体各部位。在血液中9 5 以上的 镉结合在血液细胞中的蛋白质部分。转运至组织中的镉主要贮存于肝和肾中，约 占全身镉总量的l 2 2 3 ，肺、胰、甲状腺、膀胱、睾丸、肌肉和脂肪等脏器 和组织中镉浓度中等，骨组织次之，脑组织中含量最低。 1 3 生物学性质新生儿体内并不含镉，但是随年龄增长，即使无职业接触，5 0 岁左右的人体内含镉也达2 0 3 9 p j k g 。镉经过血液输送到肾脏并蓄积起来，达到 一定量后缓慢从尿中排出( 马长山等，1 9 8 5 ) 。镉的主要生物毒性有：( 1 ) 镉具有 生殖毒性和发育毒性，可以引起睾丸、附睾及卵巢的坏死性损害和胎儿畸形或死 亡：( 2 ) 镉排泄很慢，生物半衰期在1 0 3 0 年之间，有较强的蓄积毒性；( 3 ) 镉 离子能与红细胞中的血红蛋白结合，也能与组织蛋白中的巯基形成明显稳定的会 属巯醇盐，使组织酶系统功能受损；( 4 ) 镉对肾脏有明显的毒害作用，对肾小管 的损害尤其严重可引起蛋白尿和管型尿：( 5 ) 镉可以干扰c u 、f e 、z n 、c o 等重 金属的代谢，抑制骨髓血红蛋白合成，同时可以置换骨质中的钙，导致骨质疏松 ( h o 依兹麦罗夫1 9 8 9 ) 。 1 4 镉与其他元素的相互作用镉被生物体吸收后，在体内的存在形态以及对机 体的毒性作用取决于镉的电子结构和化学特性。镉除以无机离子形式存在外，还 兰州大学硕士研究生学位论文 易与氨基酸、肽、蛋白质、核酸及脂肪酸等生物成分结合。镉与无机物的直接反 应，称为无机元素阳j 的相互作用，元素间和配位体的竞争与罱换取代作用对镉的 毒性产生拮抗作用或协同作用，对生物体的影响非常重要( 王菱，1 9 9 6 ) 。 2 硒的性质 2 1 物理化学性质硒是一种暗灰色、稀有半金属元素，原子序为3 4 ，原子量为 7 8 9 6 ，位于元素周期表v i a 族硫和碲之间。硒在自然界主要以+ 4 价存在，不溶 于水，性质稳定。硒本身无毒，但h ：s e 、s e n o ：、及硒酸盐等许多硒化合物是可 溶的，且毒性剧烈( 许嘉琳等，1 9 9 6 ) 。 2 2 硒在动物体内的吸收动物和人类主要通过胃肠道摄入硒。在自然条件f ， 正常水平的硒迁移形式主要是从自然界进入体内后和蛋白质中的硒代氨基酸结 合。一般认为可溶性硒的无机含氧酸盐如硒酸钠、亚硒酸钠、硒代氨基酸和硒代 胱氨酸等最易于被机体吸收，而硒化合物以及其他一些有机硒化合物，如硒代二 乙酸、硒代丙酸和硒代嘌呤等吸收缓慢，单质硒几乎完全不被吸收。 硒是按一定的生物学、地质学、化学和食物链等环节进入人体。在生理水平 上，动物的十二指肠是硒化合物的主要吸收部位。吸收到人体的硒进入血液后， 大部分与血红蛋白结合，小部分与球蛋白形成不牢固结合，少量进入红细胞中。 硒在体内的存留时间取决于摄入时间和数量等因素，通过胃肠道和肾脏从体内排 出，排泄速度取决于体内硒化合物的性质和数量。但是硒在体内的蓄积量较其他 会属小，且在各组织中的蓄积量不同，大致排序为肾 肝 髀 胰 睾丸 心 肺 脑。 2 3 生物学特性硒在自然界分布很广是一种亲生物元素，是动物及部分植物 必需的微量元素。其生物特性主要包括3 方面：( 1 ) 硒是人和动物必需微量元素； ( 2 ) 硒存在于1 3 种以上酶中；( 3 ) 硒作为第2 1 种氨基酸的硒代半胱氨酸，参与体 内功能蛋白质的合成( 黄海花等，2 0 0 3 ) 。现在硒普遍作为保健品添加剂和一些 富硒食品的主要成分，它是一种强的抗氧化剂，作用与v 。相似，可以预防或降 r 兰州大学硕士研究生学位论文艇 倘 低某些毒物的毒性，但在体内积累到一定量时也会产生毒性作用。目前，生命科 学领域中对硒的研究主要集中在硒与人类健康和疾病的关系，包括：硒与肿瘤、 心m 管疾病、抗衰老、艾滋病的关系：硒对其他重金属的拮抗作用：硒对生殖系 统和精子形成的影响等( c o m b e r sg ，2 0 0 4 ：李引乾，2 0 0 1 ) 。 进入体内高浓度的硒能严重破坏代谢过程并引起慢性中毒，主要生物毒性有 以下几个方面：( 1 ) 有致癌性，能诱导皮肤癌的产生：( 2 ) 对生殖功能有明显的 影响，导致精子畸形，增加胚胎死亡率；( 3 ) 影响代谢同工酶和特异酶，使磷酸 盐的代谢紊乱；( 4 ) 代替含硫化合物中的硫原子，抑制体内氧化过程；( 5 ) 能破坏 蛋氨酸结构，阻止谷胱甘肽水平降低，抑制胰岛素合成，抑制a t p 酶活性。 2 4 硒与其他元素的相互作用硒与其他元素的相互作用包括硒与一些非金属元 素、金属元素在生物效应上的拮抗、协同或其他作用。这些相互作用对它们的生 物效应有很重要的影响。元素的存在形式不同，性质不同，与其他元素的相互作 用也会不同。硒能在一些生物分子结构中取代或部分取代其他金属的位置，金属 盐和硒酸盐有竞争性拮抗现象，影响硒或其他金属在动物体内的代谢。 3 重金属对机体的毒性研究 重金属进入机体后不易排泄，逐渐积累，当超过机体生理负荷时就会引起生 理功能改变，导致急、慢性损害或远期危害。关于重金属对机体的不良影响，科 学家们通过毒性实验做了很多研究，主要包括以下一些内容： 3 1 急性实验急性毒性实验目的是探明环境污染物与机体短时间接触后所引起 的损害作用，找出污染物的作用途径、剂量与效应的关系，并为进行各种动物实 验提供设计依据。一般用半数致死量( m e d i a nl e t h a ld o s e ，l d 5 0 ) 、半数致死浓 度( m e d i a nl e t h a lc o n c e n t r a t i o n l c s o ) 或半数有效量( m e d i a ne f f e c t i v ed o s e ，e d s o ) 来表示急性毒作用的程度。在毒理研究或质量评定中，通常以l d 5 0 为标志束衡量 毒性大小。但由于急性实验h 寸问太短，动物个体差异对实验干扰较大，其结果的 q 兰州大学硕士研究生学位、论文 一，比性相对较差。毒物中重金属含量较低时，生物并不立即死亡，而是随着时i j 的延长表现出蓄积毒性。但重会属的生物毒性主要表现在其蓄积毒性方面如重 金属对生殖发育、智力成熟、消化、呼吸、神经、骨骼系统的影响等等。因此， 只研究重金属的急性毒性是远远不够的，与慢性实验结合起来才能更好的说明问 题。 3 2 生殖发育重金属可以影响人体性激素水平变化异常，尤其是睾酮、卵泡刺 激素和黄体生成素。重金属还可以减少精子头数，抑制精子形成，引起哺乳动物 生殖细胞染色体断裂，降低繁殖能力，且对子代产生许多不良影响。镉对雄性的 生殖损伤主要表现在对雄性动物的性腺、副性腺、内分泌和生育力的影响。形成 继发性生精障碍，镉对睾丸的长期损伤可以导致类似阉割的化学趋势。汞铅暴露 对小鼠精子有亚慢性毒性作用，高浓度铅影响生精细胞的微核率，降低精子数量 和活动率，增加畸形率。重金属对胚胎发育有阻断作用，破坏体内微环境稳定。 重金属铅、汞、砷和镉均可导致妊娠早期流产或胎儿畸形，杀死着床前的胚胎， 胚泡期胚胎细胞分化和蛋白质合成被明显抑制。 3 3 生理生化重金属对机体生理生化的影响主要包括酶、血液、呼吸、消化和 免疫等指标。 关于重金属污染对机体酶活性影响的研究很多，镉能降低小鼠s o d 活性，有 致癌毒性。其他许多相关研究也都认为重金属对机体内各种酶活性产生影响( 魏 经键等，2 0 0 3 ；张志云等，2 0 0 1 ：马国云等，1 9 9 5 ：苏办平等，1 9 9 4 ) 。重金属 对血液细胞形态、新陈代谢和血红蛋白的合成等都有影响。主要表现在阻断红细 胞的正常成熟、干扰m 红蛋白的形成和降低白细胞数量( 邵邻相等，2 0 0 3 ；熊亚， 2 0 0 2 ；t r a n g r i sge ta l ，1 9 9 8 ) 。呼吸道是很多重金属吸收的途径之一，长期 作用会使呼吸道对病毒的抵抗能力下将，增加呼吸道疾病的易感性( 金季等， 2 0 0 2 ；朱宝立等，2 0 0 0 ) 。重金属对心肌细胞和肝细胞产生不同程度的毒性，降 0 妒：怠 兰州大学硕士研究生学位论文岁 低肝脏解毒能力，降低药物清除率，增加药物其毒副作用( 于淑兰等，2 0 0 0 ；陈 敏等，2 0 0 0 ：r 虹等，2 0 0 0 ；e l s e n h a n sb p fa ，1 9 9 9 ；w e i d n e rwp ca 1 9 9 7 ：戴清文等，1 9 9 2 ) 。 机体免疫系统的状况与肿瘤发生发展及机体对感染的抵抗力密切相关，一些 研究表明( 张辉等，2 0 0 4 ；k r y z s t y n i a kkp a ，1 9 9 5 ) ，毒物作用于机体时， 机体免疫系统功能变化常发生在早期，在未观察到其他系统明显变化之前，就已 出现免疫功能的变化，这提示测定机体免疫功能的变化可提高毒物检测的灵敏 度，并能早期发现中毒和及时采取预防措施。免疫学检验是现在常用的简便、快 速和有效的的筛选方法。常用和基本的免疫检测指标包括a 醋酸萘脂酶( a c i d a - - n a p h t h y la c e t a t ee s t e r a s e ，a n a e ) 阳性率、淋巴细胞转化率、脏器指数、细胞 因子、吞噬指数等的测定( 王兰兰等，2 0 0 2 ) 。 重金属对人体造成的神经损害较重( 王新德等，2 0 0 2 ；卢祖能等，2 0 0 0 ：张 茂悦，1 9 8 8 ) ，急性中毒主要以轴索损害为主，随着接触毒物时间延长，造成慢 性蓄积性中毒，以不可逆性髓鞘损害为主。儿童血脑屏障发育不完善，对重金属 毒性作用易感性较高，绝大部分重金属可以透过血脑屏障蓄积于脉络从内皮细 胞，影响脑发育导致智力和学习记忆能力障碍( x u e z h e n gle ta l ，2 0 0 4 ：高 代全等，2 0 0 1 ：杜炎等，2 0 0 1 ) 。 重金属及其化合物在一定剂量时对人的遗传物质产生致突变作用，影响d n a 复制的精确性或使染色体断裂和异常改变改变( 胡宇等，2 0 0 2 ：周新文等，2 0 0 1 ： l e n o a r da ，1 9 8 4 ) ，研究重金属对机体的遗传毒性具有积极深远的意义，对重金 属毒性产生的危害机理有参考价值。 3 4 与其他物质的拮抗或协同作用会属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，m t ) 是生物 体广泛存在的一类富含巯基的低分子量非酶类蛋白质，其结构特殊，具有重金属 解毒以及储存、运输和调节生物体必需微量元素的作用。m t 可以与重金属配位 编 兰州大学硕士研究生学位论文、i 结合形成低毒或无毒络合物( y a s u t a k ea e ta l ，2 0 0 3 ：陈万东等，1 9 9 8 ) 。钙 调素可以阻断重余属与钙结合蛋白的结合，降低重金属毒性( 杨永年等，1 9 9 5 ) 。 硒虽然不能促进重金属排泄，但是可以影响重金属在体内的分布( 彭双清等， 2 0 0 2 ) 。镉是一种常见的环境污染物，对于镉与其他元素相互作用的研究报道较 多( 刘欣梅等，2 0 0 4 ：苏敏等，2 0 0 4 ；龙胜精等，2 0 0 4 ；任香梅等，2 0 0 4 ；李建 秀等，2 0 0 3 ；b i a s i a kje a l ，2 0 0 0 ；w h o ，1 9 9 2 ) ，维生素c 、e 和其他生物必 需元素、或者其他重金属等对镉的吸收、分布、蓄积、代谢和毒性都有不同程度 的影响，而且与镉和其他重金属元素的浓度、作用时间有相关性。 4 重金属的免疫毒理学研究 免疫指机体对感染源有抵抗能力，使机体不患疾病或传染病。宿主体内的免 疫系统，能识别从外界环境中入侵的病原体及其产生的毒素和内环境中内基因突 变产生的肿瘤细胞，实现免疫防卫功能，保持机体内环境稳定。免疫系统是由免 疫组织、免疫器官、免疫细胞和免疫活性分子组成。免疫细胞对病原体或肿瘤细 胞适当应答，使之清除，执行免疫防卫功能。另一方面，免疫细胞的不适当应答， 应答过高，会致过敏性疾病；应答过低，易致严重的感染；对自身组织发生应答， 导致自身免疫疾病，均对机体有害。免疫系统的重要功能就是对“自己”和“非 己”抗原的识别和应答，免疫系统在免疫功能正常的条件下，对“非己”抗原产 生排异效应，发挥免疫保护作用，主要防御机制如下图示： 强 兰州大学硕士研究生学位论文眵 a n t i l , s 琦：每皎，。曼扩 蹄； 、 f , r c 噼n v i n i k sb t c t c d al t n 蝴df m l g i p o i s o n n n j l c l n s ( 引自p a r s l o w 主编的医学免疫学第十版，2 0 0 3 ) d h 豁i m o l e c u l e 免疫是一种极为复杂的生理现象。受到很多因素的影响，可以概括为抗原、 机体和环境因素三方面( 翁朝红等，2 0 0 1 ；黄德生等，2 0 0 0 ；l e ile ta ，1 9 9 l ： t o s sse ta ，1 9 8 4 ) 。有关重金属污染的生物监测很多，免疫系统作为监测指 标之一，这方面的研究也有不少报道。机体对重金属持续处于应激状态，特异性 免疫和非特异性免疫防御体系的功能受到抑制，血液中各种免疫球蛋白含量也相 应发生变化，并且引起淋巴细胞d n a 损伤，淋巴细胞的增值能力下降。 近年来有关免疫毒性机制的研究开始得到了国内外一些学者的关注如廉旭 和陈成章( 1 9 9 4 ) 首次通过体外实验，利用消炎痛阻断( 前列腺素e 2 ) p g e 2 生 兰州大学硕士研究生学位论文 成和心得安阻断6 一胆碱能受体的外周血淋巴细胞模型，观察淋巴细胞内腺苷酸 环化酶( a t 酶) 和c a m p 的变化，提出镉的免疫毒性作用机制是激活膜的1 3 - - n 碱能受体隈异丙肾上腺素一c a m p 机制、抑制p g e 2 一c a m p 机制。这一见解得 到黎大明( 1 9 9 7 ) 等体内和体外实验的证实，同时体内实验发现镉f 6 6 9 m g k g ) 染毒1 4 天引起大鼠淋巴细胞磷酸二酯酶活性降低，这可能是淋巴细胞c a m p 升 高的原因之一。此外，不论是体外或体内实验均观察到高剂量镉引起巨噬细胞吞 噬功能下降，体外实验发现低剂量镉所引起吞噬细胞分泌p g e 2 增加的现象。董 淑云等( 1 9 9 9 ) 用体内实验作更深入的研究，除采用上述指标外，增加了酚妥拉 明阻断一受体动物模型，测定血淋巴细胞和脾细胞b 一肾上腺素能受体密度、 t 淋巴细胞增淋巴细胞增殖功能( 用刀豆蛋白刺激) 、t 淋巴细胞亚群、淋巴细胞 膜脂质过氧化物、血浆去甲肾上腺素、肾上腺素等。发现b 一受体阻断后镉引起 脾细胞和血淋巴细胞增殖功能抑制和t 细胞亚型的改变得以恢复或影响减轻， 再一次提示镉免疫毒性的d 一受体一c a m p 机制确实存在，a 一受体机制并非主 要。重金属导致的职业病患者中，矽肺病人占很大比重，在矽肺的发生发展上， 已进行不少免疫机制方面的研究。目前认为s i 0 2 对肺泡巨噬细胞膜为主的生物 膜损伤，是矽肺发生发展的重要起因。张卓等( 1 9 9 8 ) 的体外研究发现，低剂量 s i 0 2 使肺泡巨嗜细胞的乳酸脱氢酶活性增加，k + 含量和乳酸脱氢酶活性改变存 在剂量一反应和时问一效应关系，这一结果支持生物膜损伤机制。 环境因素联合作用对免疫系统影响的机制研究亦开始涉及，如提出紫外线与 氯化镉联合作用引起淋巴细胞环磷酸腺苷明显升高的协同作用可能是“激素效 应”的结果。醋酸锌对氯化汞免疫毒性的保护作用可能是由于预先给予醋酸锌， 提高c u z n - - s o d 的活性，清除自由基，因而能保护胸腺和脾脏免受氯化汞引起 的脂质过氧化损伤。硒对氯化汞免疫毒性的拮抗作用，可能与其对自由基的直接 清除作用和提高抗氧化活性有关( 连祥霖等，1 9 9 8 ；黎大明等，1 9 8 9 ) 。 我国免疫毒性研究也涉及到特异免疫和非特异免疫、体液和细胞免疫等各个 1 4 兰州大学硕士研究生学位论文、； 国 方面。研究的环境因素包括了物理因素( 电离辐射、微波、紫外线、工频电场) 、 物理一化学因素( - - 氧化硅、石棉纤维) 和化学因素( 锰、铝、镍、镉、汞、砷、 o 。c s ：、硝酸烯钍、芥子气、氯仿、甲醛、氯丁二烯、镉金属硫蛋白、苯并a 芘、烹调油烟、自来水有机浓集物以及燃煤空气颗粒物) 等( 陈成章，2 0 0 3 ；史 志诚，2 0 0 l ：黎大明，1 9 8 9 ) 。 5 研究内容及目的意义 一些研究表明，毒物作用于机体时，机体免疫系统功能变化常发生在早期， 在未观察到其他系统明显变化之前，就已出现免疫功能的变化，这提示测定机体 免疫功能的变化可提高毒物检测的灵敏度，并能早期发现中毒和及时采取预防措 施，可作为卫生标准制定的主要指标。 白银是我国主要的有色金属产区，在生产过程中排出的“三废”严重污染周 围环境，兰州镉污染相对也较严重，镉是这一地区最具有代表性的重金属污染物 ( 黄莉，1 9 9 9 ) 。 硒在机体的生命活动过程中具有重要的生物学作用( 朱善良，2 0 0 4 ) ，人们 普遍认为硒对健康至关重要，日常补硒具有防病治病，提高生命质量的作用，各 国对硒缺乏和硒的营养价值的研究进展迅速。近几年来，富硒食品、药物和保健 品逐渐走进大众生活，科研人员的视野也从缺硒扩展到硒中毒。在一定剂量和范 围内适量硒是可以增强机体的抵抗力但过量( 中毒量) 硒具有免疫毒性和细胞毒 性( b r o w nke ta ，2 0 0 1 ) ，国内对这方面的报道甚少。所以我选用染毒剂量的 硒，目的在于揭示硒中毒、为合理补硒和预防硒中毒提供科学依据和揭示硒对镉 免疫毒性的影响机制。 本文以昆明种健康小鼠为实验动物，以镉和硒为污染物，主要进行了下几方 面研究： 兰州大学硕士研究生学位论文 ( 1 ) 镉和硒急性毒性实验，确定半数致死剂量( l d 5 0 ) 。 ( 2 ) 镉单一毒性对小鼠细胞免疫和体液免疫功能的影响。 ( 3 ) 硒单一毒性对小鼠细胞免疫和体液免疫功能的影响。 ( 4 ) 镉和硒联合染毒对小鼠免疫功能的影响。 ( 5 ) 镉和硒之间互相作用的研究。 通过观察实验性重金属染毒对小鼠免疫功能的影响，为进一步揭示其对免疫 损伤的过程和机制提供科学依据。 6 实验中各项指标意义说明 a 一醋酸萘酯酶阳性率：人和动物的t 淋巴细胞胞浆内含有a 一醋酸萘酯酶， 能将a 一醋酸萘酯水解成醋酸和a 一萘酚。a 一萘酚和六氮副品红偶合成紫红色的 a 一萘酚六氮副品红。因此将血细胞涂片置于含旺一醋酸萘酯和六氮副品红的孵 育液中孵育一定时间后，在t 淋巴细胞酯酶存在部位形成不溶性紫红色沉淀物。 对于了解活体内t 淋巴细胞的动态变化有一定实用价值。 淋巴细胞转化率：淋巴细胞转化实验( l y m p h o c y t et r a n s f o r m a t i o nt e s t ， l t t ) 是检测机体细胞免疫功能的一种体外实验。t 淋巴细胞在体外培养的情况 下，当受到植物血凝素( p h y t o h e m a g g l u t i n i n ，p h a ) 等有丝分裂原的非特异性 刺激和特异性抗原刺激后，可转化为淋巴母细胞，发生特征性形态变化。临床上 常用p h a ，可使7 0 左右t 淋巴细胞转化为淋巴母细胞，转化率的高低可以反映 机体细胞免疫功能的水平。常用m t t 比色法( t h i a z o l yb ll l e m t t ) 检测淋巴细 胞增值情况，其原理是：增值期淋巴细胞可以通过线粒体能量代谢过程中琥珀酸 脱氢酶的作用使淡黄色m t t 还原为蓝黑色结晶状甲臌，沉积于细胞内或周围形 成的甲躜量与细胞增值程度呈正相关，通过m t t 比色法测定甲躜量即可了解细胞 t 淋巴细胞增值情况。 6 矿氏 兰州大学硕士研究生学位论文 慈箩 脏器指数：近年来免疫学研究应用了免疫器官脏器指数这一指标来评价免疫 功能的状况，脏器指数是用动物免疫器官( 如脾脏、胸腺、法氏囊等) 的重量与 相应动物体重的比值。从免疫器官的重量来反映免疫功能状况。 半数血清溶血素( h e m o l y s i n ，h c s o ) ：用绵羊红细胞( s h e e pr e db l o o dc e l l ， s r b c ) 免疫动物，动物便产生s r b c 抗体( 溶血素) ，取一定量的抗血清与s r b c 一起孵育，在补体参与下便产生溶血现象，释放出血红蛋白，通过测定血红蛋白 含量来反映动物血清中溶血素的量，以此反映体液免疫功能。 外周血涂片白细胞观察：( 1 ) 中毒颗粒见于中性粒细胞的毒性变化，比正常 中性颗粒粗大，大小不等，分布不均匀，染色较深，呈黑色或紫黑色。有时颗粒 很粗大，与嗜碱粒细胞易混淆；有时细小而稀少，散杂在正常中性颗粒之中。( 2 ) 空泡也为中性粒细胞变化之一，可为单个，但常为多个。大小不等，亦可在核中 出现。被认为是细胞脂肪变性的结果。( 3 ) 退行性变，常见者有胞体肿大、结构 模糊、边缘不清晰、核固缩、核肿胀和核溶解( 染色质模糊、疏松) 等等。如胞 质破裂后消失，只剩胞膜，则成裸核或篮状细胞，退行性变亦可见于衰老细胞， 在正常情况下为数极少。( 4 ) 巨多核中性粒细胞：成熟中性细胞胞体增大，核分 叶过多，常为3 9 叶，甚至1 2 一1 5 叶。各叶大小差别很大。( 5 ) 异常淋巴细胞， 多见空泡型，胞体大，圆、椭圆形或不规则形。核圆、肾形或分叶状、常偏位。 染色质粗糙，呈租网状或小块状，排列不规则。胞质丰富，染深蓝色，含空泡或 呈泡沫状。不规则型，胞体较大，外形常不规则，可有多数足。核形状及结构同 空泡型，染色质较粗糙致密。胞质量丰富，染色淡蓝或灰蓝色，有透明感，边缘 处着色较深。 熊 兰州大学硕士研究生学位论文e 拶 1 材料 1 1 实验材料 材料与方法 昆明种健康成年小鼠，雌雄各半，体重1 9 8 4 5 9 ，均由兰4 , 1 i 生物制品研 究所动物实验中心提供，医动字1 4 0 0 l 。 新鲜绵羊红细胞，由兰州生物制品所提供健康绵羊全血，自制绵羊红细胞悬 液。豚鼠( 不少于3 只) 血清，由兰州生物制品所提供。 1 2 染毒重金属 亚硒酸钠( n a 2 s e 0 3 ，天津市科米欧化学试剂开发中心) ，氯化镉( c d c l 2 5 h 2 0 ， 上海亭新化工厂) 。 1 t3 试剂 r p m i 一1 6 4 0 培养液( g i b c o 公司) ，植物血凝素( p h y t o h e m a 9 9 1 u t i n i n ，p h a ) 、 四甲基偶氮唑蓝( t h i a z o l yb l u e ，m t t ) 、台盼蓝染色素( t r y p a nb l u e ，t b